一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子及應用制造技術

本發明專利技術公開了一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子及應用，所述西門利克森林病毒復制子為含有熒光蛋白基因和SEQ?ID?NO.4所示序列的pSFV-replicon。利用該復制子可制備出攜帶綠色熒光蛋白基因且具有單次感染性的SFV病毒，該復制子或其制備的病毒顆粒在非人靈長類，特別是猴神經細胞的標記、細胞精細形態的描繪、神經環路標記、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制病毒作用機制、病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立、病毒復制和致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。

【技術實現步驟摘要】
一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子及應用
本專利技術屬于生物
，更具體涉及一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子及應用。
技術介紹
人腦是自然界中最為復雜的系統之一,而神經網絡是大腦行使功能的基礎，神經網絡的正常連接，使得機體產生正常的生理活動，如認知、學習、記憶和恐懼等；神經網絡的異常往往導致神經疾病的出現，尚無有效手段來治療這些神經疾病。目前，正常生理活動和致病機制均不清楚，主要的原因在于腦神經網絡連接信息的缺乏。因此，開展腦神經環路的研究而繪制高精度的腦功能連接圖譜，對于了解人的生理活動和致病機制具有重要的意義。西門利克森林病毒(Semlikiforestvirus，SFV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為12kb。基因組編碼的多聚蛋白可切割成4個結構蛋白(C、P62、6K和E1)和4個非結構蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有廣泛的宿主范圍，包括：人、鼠、猴等，能夠感染神經系統，一方面不利于人類的健康和農業生產，另一方面，這種感染特性可以使得其成為介導外源基因到宿主體內的載體，另外，西門利克森林病毒感染腦神經系統的特性使其成為具備解析神經環路的能力。但是因為存在一系列工藝和技術改造方面的問題，所以目前其還沒有應用到細胞精細形態的描繪、靈長類神經環路的標記等方面。而本專利技術通過一系列的條件優化、系統的改造和升級，獲得了一種高效且穩定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統，明確了其在非人靈長類神經環路應用方面的效果，為開展腦科學研究提供了良好的工具系統。隨著分子生物學的不斷發展，科學家已經能夠通過反向遺傳學的手段來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研究提供了良好的工具。因此，本專利技術分別采用不同的技術途徑獲得了一種高效且穩定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統。將在神經細胞和非神經細胞精細形態的描繪、靈長類和非靈長類解析腦神經環路、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值和前景。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供了一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子，該復制子為含有熒光蛋白基因和SEQIDNO.4所示序列的pSFV-replicon。該復制子可用于西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備。本專利技術還有一個目的在于提供了一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子的應用，包括該復制子可用于制備西門利克森林病毒類病毒顆粒。制備出的病毒樣顆粒可用于非人靈長類神經細胞快速標記，同時，該復制子還可用于蛋白表達、基因治療、神經細胞精細形態的描繪、神經環路的解析、神經環路稀疏標記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。為了實現以上目的，本專利技術采用如下技術方案：一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子，該復制子為含有熒光蛋白基因和SEQIDNO.4所示序列的pSFV-replicon。優選的，使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,Ketal.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQIDNO:1和SEQIDNO:4片段插入到pSFV-replicon，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pSFV-replicon-EGFP，其序列為SEQIDNO:8所示。一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子的應用，包括：1.西門利克森林病毒復制子制備表達綠色熒光蛋白的單次感染性的西門利克森林病毒類病毒顆粒：使用NruI分別酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,Petal.,(1993)Biotechnology11,916-920.)，使用MEGAscriptSP6TranscriptionKit分別體外轉錄酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper為RNA，并轉染BHK21細胞，37℃，5％(v/v)CO2培養箱中培養，收集上清，即得。2.西門利克森林病毒復制子制備出的病毒樣顆粒在制備非人靈長類神經細胞快速標記藥物中的應用，特別是用于猴神經細胞的快速標記。本專利技術提供的一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子的制備方法也適合于與西門利克森林病毒同科的病毒的構建，例如委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus,VEEV)和辛德畢斯病毒(Sindbisvirus,SINV)。西門利克森林病毒復制子或其制備出的病毒樣顆粒不僅可用于非人靈長類神經細胞的快速標記，還可用于蛋白表達、基因治療、神經細胞精細形態的描繪、神經環路的解析、神經環路稀疏標記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析。本專利技術與現有技術相比，具有以下優點和效果：1.本專利技術提供了一種高效、便捷的表達外源蛋白的類西門利克森林病毒的顆粒，該平臺制備的病毒具有可視化的特點，便于開展相關的研究。2.本專利技術對于開展非人靈長類神經細胞的標記具有重要價值，同時對于其他應用性研究(如蛋白表達、基因治療、細胞精細結構描繪、神經環路標記、藥物篩選、抗原表位分析、新型疫苗和診斷試劑等)和基礎性研究(如復制、包裝盒致病機制等)具有重要的現實意義和廣泛的應用價值。3.本專利技術制備的類病毒顆粒能夠在數天的時間內快速標記非人靈長類神經細胞。4.解析神經環路結構是開展腦科學研究的基礎，良好用于神經環路標記的工具對于解析神經環路的結構具有重要意義。SFV能夠感染人和鼠等動物的神經細胞，具有作為神經環路標記的潛力。本專利技術不僅能夠用于非人靈長類動物，而且還能用于非靈長類動物的腦科學研究。附圖說明圖1為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的構建和制備示意圖。A：一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒復制子的構建示意圖；B：一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備示意圖。圖2為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒表達熒光示意圖。A：未轉染RNA的細胞；B：共轉染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21細胞表達綠色熒光蛋白；圖3為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒單次感染細胞。A：類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；B：類病毒顆粒感染BHK21細胞后收集的上清感染BHK21細胞，沒有熒光蛋白的表達，即沒有病毒產生；圖4為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒生長曲線。A：類病毒顆粒感染BHK21細胞后表達綠色熒光蛋白；B：不同時間收集類病毒顆粒的滴度分析；圖5為一種穩定攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒快速標記非人靈長類動物(猴)神經細胞的示意圖。猴腦感染表達EGFP的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子或其制備的病毒類病毒顆粒在制備非人靈長類神經細胞標記藥物中的應用。

【技術特征摘要】
1.一種用于非人靈長類神經細胞快速標記的西門利克森林病毒復制子或其制備的病毒類病毒顆粒在制備非人靈...

【專利技術屬性】
技術研發人員：賈凡，徐富強，胡新天，吳詩昊，朱續濤，
申請(專利權)人：中國科學院武漢物理與數學研究所，
類型：發明
國別省市：湖北,42