一種重組馬立克氏病病毒meq和vIL?8雙基因缺失株的構(gòu)建及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種重組血清Ⅰ型馬立克氏病病毒(marek’s?disease?virus,MDV)(BZ?1株)，其實(shí)際上是將分離的MDV強(qiáng)毒株BJ07的致病相關(guān)基因(meq和vIL?8基因)同時(shí)敲除，所構(gòu)建的MDV基因缺失株(BZ?1株)沒(méi)有致病性，不會(huì)誘發(fā)雞的腫瘤，對(duì)雞群也沒(méi)有免疫抑制作用。將BZ?1株用作馬立克氏病活疫苗的生產(chǎn)毒株所制備的疫苗，預(yù)防超強(qiáng)毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病，其保護(hù)性免疫效果優(yōu)越于目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的CVI988/Rispens株疫苗。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種重組馬立克氏病病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的構(gòu)建及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及一種重組馬立克氏病病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
馬立克氏病(Marek’sdisease,MD)，是由馬立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起雞的一種最常見(jiàn)的淋巴細(xì)胞增生性疾病，以外周神經(jīng)、虹膜、皮膚、肌肉和各內(nèi)臟器官的淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)、增生和腫瘤形成為特征。本病早在1907年由匈牙利的獸醫(yī)病理學(xué)家馬立克首先發(fā)現(xiàn)，并在1961年命名為馬立克氏病。現(xiàn)在世界各主要養(yǎng)雞國(guó)家和地區(qū)均有流行，在我國(guó)也是經(jīng)濟(jì)意義上最重要的禽病之一，對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬立克氏病病毒基因組的Meq基因N末端含有一個(gè)堿基亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與jun/fos致癌基因家族相似，C末端富含脯氨酸的重復(fù)區(qū)域與WT-1腫瘤抑制基因相似。Meq基因在淋巴瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系中恒有表達(dá)，在MDV轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞系MSB-1細(xì)胞中表達(dá)的Meq反義RNA可以減少軟瓊脂上細(xì)胞集落的形成，在轉(zhuǎn)染的大鼠細(xì)胞中Meq過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制，上述結(jié)果均顯示Meq基因與致腫瘤的密切相關(guān)性。2008年美國(guó)利用傳染性克隆技術(shù)成功的將馬立克氏病病毒(MDV)超強(qiáng)毒株Md5中主要的致腫瘤基因meq基因敲除掉，獲得的meq基因缺失株-rMd5Δmeq完全喪失致病性，而且能誘導(dǎo)比CVI988/Rispens更好的免疫保護(hù)效果，甚至能完全抵御MDV特超強(qiáng)毒648A的攻擊。2010年，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室利用同源重組技術(shù)敲除掉MDVGX0101的meq基因，構(gòu)建的GX0101Δmeq證實(shí)完全喪失致瘤性，并且能誘導(dǎo)比商品化疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保護(hù)效果。敲除Meq基因雖然能夠使MDV強(qiáng)毒的致瘤性喪失，但Meq缺失株仍能引起輕微的免疫抑制。MDV編碼一種病毒類白細(xì)胞介素8(vIL-8)，與哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素8(IL-8)及其他IL-8同源類似物，均能引起細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移和炎癥反應(yīng)。致腫瘤毒株(RB1B、Md5)的vIL-8基因的缺失證實(shí)vIL-8并不影響MDV的轉(zhuǎn)化和潛伏期，但是v-IL8基因缺失突變株能顯著降低感染雞的腫瘤率，并且不再引起雞體胸腺法氏囊的萎縮，說(shuō)明v-IL8基因與MDV導(dǎo)致雞群的免疫抑制性密切相關(guān)。目前應(yīng)用于MDV研究的同源重組技術(shù)主要是RedET同源重組技術(shù)(ZhangY,BuchholzF,MuyrersJP,StewartAF:AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli.Naturegenetics1998,20(2):123-128.)。RedET重組系統(tǒng)不但具有很高的同源重組效率，而且一般僅需要長(zhǎng)50bp的同源臂。通過(guò)PCR技術(shù)將需要修飾的MDV基因的同源臂直接加在打靶基因的兩側(cè)。將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進(jìn)含有MDVBAC感染性克隆的細(xì)菌中，經(jīng)同源重組酶介導(dǎo)同源重組，兩端帶有同源臂的目的基因片段就能直接插入到MDVBACDNA的同源區(qū)部位。利用RedET重組系統(tǒng)在MDVBAC的感染性克隆基礎(chǔ)上可以對(duì)MDV任意基因任意長(zhǎng)度的進(jìn)行插入或者刪除等修飾。目前已經(jīng)有RedET重組系統(tǒng)的商品化試劑盒：Counter-SelectionBACModificationKit(德國(guó)GeneBridges公司)，可以對(duì)MDV基因組中的基因進(jìn)行敲除，該技術(shù)在敲除的同時(shí)沒(méi)有往MDV基因組中帶來(lái)任何的多余序列。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供了一種重組血清Ⅰ型馬立克氏病病毒(BZ-1株)，本研究基于MDV強(qiáng)毒株BJ07的BAC(Bacterialartificialchromosome，BAC)感染性克隆，利用RedET重組系統(tǒng)，構(gòu)建的MDVBJ07株meq、vIL-8基因的缺失株(BZ-1株)不僅喪失對(duì)雞的致病性和致腫瘤性，而且由于同時(shí)敲除了vIL-8基因，使其免疫抑制性也喪失，因而具有相對(duì)更高的安全性。本專利技術(shù)的技術(shù)方案1.一種重組馬立克氏病(Marek’sdiseasevirus,MDV)病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的構(gòu)建，其特征在于該株病毒是在強(qiáng)毒MDVBJ07株(CGMCCNo.13598)的基因組中同時(shí)缺失了馬立克氏病病毒致病性相關(guān)vIL-8基因和meq基因，其vIL-8基因序列如SeqIDNo:1所示，Meq基因序列如SeqIDNo:2所示；該重組毒株為血清Ⅰ型，被命名馬立克氏病病毒為BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13395；該BZ-1株對(duì)雞無(wú)致瘤致病性，不引起雞群免疫抑制。2.本專利技術(shù)所述的重組馬立克氏病病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的應(yīng)用，其特征在于該CGMCCNo.株重組病毒在禽類宿主中誘導(dǎo)抗雞馬立克氏病保護(hù)性免疫的應(yīng)用。3.本專利技術(shù)所述的重組馬立克氏病病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的應(yīng)用，其特征在于該CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重組病毒在作為馬立克氏病疫苗生產(chǎn)毒株的應(yīng)用。4.本專利技術(shù)所述的重組馬立克氏病病毒meq和vIL-8雙基因缺失株的應(yīng)用，其特征在于該CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重組病毒在作為載體構(gòu)建病毒活載體疫苗中的應(yīng)用。本專利技術(shù)具體實(shí)施方法1.病毒構(gòu)建敲除掉meq、vIL-8基因，構(gòu)建完全喪失致瘤性的MDV基因缺失病毒株，該重組毒株為血清Ⅰ型，被命名馬立克氏病病毒為BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13395；該重組病毒的DNA序列模式圖如附圖1所示。注:Meq和vIL-8基因基因均為兩個(gè)拷貝(分別位于MDV基因組的TRL和IRL區(qū)域)，兩個(gè)拷貝在基因組中的序列反向互補(bǔ)，本專利技術(shù)中，BZ-1株Meq和vIL-8基因兩個(gè)拷貝均進(jìn)行了缺失見(jiàn)圖2和圖3。2.重組病毒MDVBZ-1株的驗(yàn)證：制備了特異的針對(duì)MDVmeq和vIL-8基因基因的小鼠多價(jià)血清，進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，證實(shí)BZ-1病毒的meq基因和vIL-8基因不表達(dá)，其meq基因和vIL8基因已經(jīng)被完全敲除掉。PCR技術(shù)可以同樣應(yīng)用于meq、vIL-8基因的檢測(cè)。3.重組病毒MDVBZ-1株的對(duì)SPF雞的致病性BZ-1株以5000PFU劑量感染25只1日齡SPF雞，感染13周后，無(wú)MD特異性死亡與病變，無(wú)腫瘤形成；其體重及中樞性免疫器官胸腺和法氏囊與體重的比都與空白對(duì)照雞無(wú)顯著差異，不會(huì)引起雞群的免疫抑制。4.重組病毒MDVBZ-1株對(duì)SPF雞的免疫效力重組病毒BZ-1株應(yīng)用于SPF雞的免疫實(shí)驗(yàn)中，具體步驟如下：100只1日齡SPF雞，隨機(jī)分成4組。第一組接種BZ-1株，免疫劑量為2000PFU/只。第二組接種CVI988/Rispens，免疫劑量為2000PFU/只。第三組為攻毒對(duì)照組，第四組為空白對(duì)照組。7日齡進(jìn)行MDV超強(qiáng)毒Md5攻擊，攻擊后觀察記錄雞只死亡，90天后剖殺進(jìn)行肉眼病理觀察并取臟器用10％甲醛固定以作組織本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組馬立克氏病病毒(Marek’s?disease?virus,MDV)meq和vIL?8雙基因缺失株的構(gòu)建，其特征在于該株病毒是在強(qiáng)毒MDV?BJ07株(CGMCC?No.13395)的基因組中同時(shí)缺失了馬立克氏病病毒致病性相關(guān)vIL?8基因和meq基因，其vIL?8基因序列如Seq?ID?No:1所示，Meq基因序列如Seq?ID?No:2所示；該重組毒株為血清Ⅰ型，被命名馬立克氏病病毒為BZ?1株，已于2017年01月11日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.13395；該BZ?1株對(duì)雞無(wú)致瘤致病性，不引起雞群免疫抑制。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組馬立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)meq和vIL-8雙基因缺失株的構(gòu)建，其特征在于該株病毒是在強(qiáng)毒MDVBJ07株(CGMCCNo.13395)的基因組中同時(shí)缺失了馬立克氏病病毒致病性相關(guān)vIL-8基因和meq基因，其vIL-8基因序列如SeqIDNo:1所示，Meq基因序列如SeqIDNo:2所示；該重組毒株為血清Ⅰ型，被命名馬立克氏病病毒為BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13395；...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：畢建敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京邦卓生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京,11