一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法技術

本發明專利技術涉及一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，該方法涉及生物技術領域，具體涉及新的核苷酸序列、原核表達系統的構建和制備方法。將人工合成的6?ost?3序列連接到pET?28a表達載體上，并轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞中，經IPTG誘導表達胞內可溶性蛋白。溶菌酶破碎細胞，并收集上清，經鎳柱純化獲得6?OST?3酶蛋白，其比酶活為1.53U/mg。本發明專利技術使用大腸桿菌表達制備6?OST?3酶蛋白，具有實驗條件簡單、成本低廉的優點，6?OST?3作為工具酶對于大分子肝素的修飾合成具有重要意義。

【技術實現步驟摘要】
一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法
一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，該方法涉及生物
，具體涉及新的核苷酸序列、原核表達系統的構建和制備方法。
技術介紹
硫酸乙酰肝素(Heparansulfate，HS)是一種多硫酸化多糖，它廣泛存在于細胞表面及細胞外基質，參與了多種生物反應過程，如胚胎發育過程、凝血過程、病毒感染過程等等。研究發現，硫酸乙酰肝素具有多種生物活性，包括抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等等，且其生物功能與多糖上修飾的硫酸基團密切相關。目前，肝素寡糖主要通過化學合成的方法進行制備。但是對于合成五糖以上分子量的肝素，單獨使用化學合成十分困難。酶具有專一性和高效性，且其反應條件溫和，不會對大分子的底物的結構造成變化，因此可用于大分子肝素的合成修飾過程。在硫酸乙酰肝素的生物合成過程中，首先合成的是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖交替連接形成的主糖鏈，即肝素前體，然后進行修飾反應獲得具有生物活性的肝素。共有六種酶參與了多糖鏈的修飾反應：N-硫酸基轉移酶(N-sulfotransferase)、C5異構酶(C5epimerase)、2-O-硫酸基轉移酶(2-O-sulfotransferase，2-OST)、3-O-硫酸基轉移酶(3-O-sulfotransferase，3-OST)和6-O-硫酸基轉移酶(6-O-sulfotransferase，6-OST)，分別對肝素前體糖鏈的不同位點進行修飾。本專利技術通過分析小鼠的6-OST-3的催化活性區間蛋白的氨基酸序列，得到相應的經密碼子優化的新雙鏈核苷酸序列(6-ost-3)，利用大腸桿菌原核表達系統，表達并制備了6-OST-3的催化活性區間蛋白，其作為工具酶對于大分子肝素的修飾合成具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是使用對實驗條件要求較低的原核表達系統，表達小鼠的6-OST-3的催化活性區間蛋白，獲得可溶性表達的酶蛋白以用于肝素的修飾合成反應。一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，包括下列步驟：(1)人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。(2)將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，獲得重組工程菌。(3)將工程菌接種至LB培養基中過夜震蕩培養作為種子液，再將種子液以1％的接種量接種至LB發酵培養基中，當菌液吸光度至0.4-0.6時加入IPTG在20℃誘導10-12h，離心收集菌體。(4)菌體重懸于pH7.4的磷酸緩沖液，加入溶菌酶破碎細胞，離心收集上清。(5)溶菌上清經鎳柱純化，獲得6-OST-3酶蛋臼溶液。本專利技術利用大腸桿菌原核表達系統，在胞內可溶性表達了6-OST-3酶蛋白，并利用鎳柱純化獲得酶溶液，具有方法簡單、成本低廉的優點。經BCA法測量，酶蛋白溶液中蛋臼含量為2.44mg/mL。經測定，其酶活力為1.53U/mg。附圖說明圖1為BCA法蛋白含量測定的標準曲線圖圖2為酶活性測定中的酶反應體系說明圖圖3為酶活性測定中產物PNP的標準曲線圖具體實施方式現結合實施例，對本專利技術作詳細闡述。實施例1：(1)重組質粒的構建：人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。(2)工程菌的構建：將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，經卡那霉素抗性平板篩選，獲得重組工程菌。(3)工程菌的誘導表達：將工程菌接種至LB培養基中37℃震蕩培養過夜作為種子液，取1mL種子液接種至100mL的LB發酵培養基中37℃震蕩培養，當菌液吸光度至0.6時加入IPTG在20℃誘導10h，8000rpm離心10min收集菌體。(4)菌體破碎：將步驟(3)所收集的菌體重懸于4mL含有500mM的NaCl、20mM磷酸三鈉的pH7.4的磷酸緩沖溶液中，加入終濃度為1mg/mL的溶菌酶于4℃放置過夜，12000rpm離心15min收集上清。(5)鎳柱純化：將步驟(4)中所得的溶菌上清上樣至鎳柱，以含10mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為清洗緩沖液，以含100mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為洗脫緩沖液，收集洗脫液組分并用磷酸緩沖液透析去除咪唑，最后得到酶溶液。實施例2：(1)重組質粒的構建：人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。(2)工程菌的構建：將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，經卡那霉素抗性平板篩選，獲得重組工程菌。(3)工程菌的誘導表達：將工程菌接種至LB培養基中37℃震蕩培養過夜作為種子液，取1mL種子液接種至100mL的LB發酵培養基中37℃震蕩培養，當菌液吸光度至0.4時加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG在20℃誘導12h，8000rpm離心10min收集菌體。(4)菌體破碎：將步驟(3)所收集的菌體重懸于4mL含有500mM的NaCl、20mM磷酸三鈉的pH7.4的磷酸緩沖溶液中，加入終濃度為1mg/mL的溶菌酶于4℃放置過夜，12000rpm離心15min收集上清。(5)鎳柱純化：將步驟(4)中所得的溶菌上清上樣至鎳柱，以含10mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為清洗緩沖液，以含100mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為洗脫緩沖液，收集洗脫液組分并用磷酸緩沖液透析去除咪唑，最后得到酶溶液。實施例3：(1)重組質粒的構建：人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。(2)工程菌的構建：將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，經卡那霉素抗性平板篩選，獲得重組工程菌。(3)工程菌的誘導表達：將工程菌接種至LB培養基中37℃震蕩培養過夜作為種子液，取1mL種子液接種至100mL的LB發酵培養基中37℃震蕩培養，當菌液吸光度至0.6時加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG在20℃誘導12h，8000rpm離心10min收集菌體。(4)菌體破碎：將步驟(3)所收集的菌體重懸于4mL含有500mM的NaCl、20mM磷酸三鈉的pH7.4的磷酸緩沖溶液中，加入終濃度為1mg/mL的溶菌酶于4℃放置過夜，12000rpm離心15min收集上清。(5)鎳柱純化：將步驟(4)中所得的溶菌上清上樣至鎳柱，以含10mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為清洗緩沖液，以含100mM咪唑的磷酸緩沖溶液作為洗脫緩沖液，收集洗脫液組分并用磷酸緩沖液透析去除咪唑，最后得到酶溶液。實施例4：蛋白含量測定：BCA法測定，標準曲線結果如下表樣品名稱01234567蛋白濃度(mg/mL)00.0250.050.10.20.30.40.5A5620.0970.1270.1540.2030.3110.4160.5190.597樣品稀釋10倍后測定，其吸光度為0.352，經計算蛋白含量為2.44mg/mL。實本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，其主要特征在于所述方法包括如下步驟：(1)人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6?ost?3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET?28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET?28a/6?ost?3。(2)將表達質粒pET?28a/6?ost?3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，獲得重組工程菌。(3)將工程菌接種至LB培養基中過夜震蕩培養作為種子液，再將種子液以適當的接種量接種至LB發酵培養基中，當菌液吸光度至一定范圍時加入IPTG在誘導表達，離心收集菌體。(4)菌體重懸于pH7.4的磷酸緩沖液，加入溶菌酶破碎細胞，離心收集上清。(5)溶菌上清經鎳柱純化，獲得6?OST?3酶蛋白溶液。

【技術特征摘要】
1.一種肝素前體硫酸化修飾酶的表達方法，其主要特征在于所述方法包括如下步驟：(1)人工合成兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點的6-ost-3序列，經雙酶切后插入表達質粒pET-28a的NdeI/XhoI的位點，獲得表達質粒pET-28a/6-ost-3。(2)將表達質粒pET-28a/6-ost-3轉化入大腸桿菌BL21感受態中，獲得重組工程菌。(3)將工程菌接種至LB培養基中過夜震蕩培養作為種子液，再將種子液以適當的接種量接種至LB發酵培養基中，當菌液吸光度至一定范圍時加入IPTG在誘導表達，離心收集菌體。(4)菌體重懸于pH7.4的磷酸緩沖液，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：尹鴻萍，楊軼偉，王瑩，黃鳳杰，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇,32