一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ?2及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ?2及其制備方法。該產物是由布魯氏菌S2株基因編號(GI)為490823642的基因原核表達，并經谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱與谷胱甘肽梯度洗脫法純化獲得。將該產物作為包被抗原，可作為區分動物布魯氏菌疫苗免疫和自然感染血清檢測的診斷抗原。將該抗原分別與疫苗免疫抗體及自然感染抗體進行免疫印跡(Western?blot)，差異明顯。將該抗原作為間接酶聯免疫吸附測定法(ELISA)包被抗原，檢測數百份布病臨床血清樣本，鑒別診斷效果顯著。

【技術實現步驟摘要】
一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ-2及其制備方法
本專利技術涉及一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ-2及其制備方法，屬于獸醫微生物學診斷領域。
技術介紹
布魯氏菌病(Brucellosis簡稱為布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病。人感染布病主要來于患病動物及其產品。我國與人類布病有關的傳染源主要是患病羊、牛，但以羊種布魯氏菌危害最為嚴重(朱良全etal.微生物學通報,2015(01):171～177；吳清民.獸醫導刊,2011(09):46～47)。血清學方法是當前診斷動物布病的主要方法，而疫苗接種是預防動物布病的重要手段。布病已有的血清學診斷主要基于檢測抗布魯氏菌脂多糖抗體，由于我國現有動物布病疫苗株(S2、A19和M5)與野毒感染株均屬于光滑型菌株，均誘導機體產生抗脂多糖抗體，因而無法通過現有血清學方法區分疫苗免疫和自然感染(毛開榮,等.動物布魯氏菌病診斷技術.中國農業出版社，2014.)。不過，強弱毒布魯氏菌感染宿主后的血清學抗體應答出現明顯差異，為從血清學上篩選區分自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷抗原提供了一些背景和線索。如已有研究表明，強毒感染布魯氏菌后，7天可檢測到抗體，15天抗體水平達到最高，其凝集抗體滴度達到1：3000，隨后開始下降，60天后抗體水平已經低于7天時的抗體水平，而240天后抗體為陰性(GaoXL.etalTurkishJournalofVeterinaryandAnimalSciences,2015,39:271～278)。而布魯氏菌疫苗S2免疫綿羊后，2周后開始檢測到抗體，第30天抗體水平達到最高，其滴度為1：120，隨后開始下降，至180天后抗體為陰性。上述顯示的免疫與自然感染血清之間的差異信息為鑒別診斷點的篩選開辟了新思路。據報道，膜蛋白占據病原微生物總蛋白質的大約30％～40％，不僅是治療藥物和疫苗開發的主要靶點所在，而且含有保護性抗原成分，因而成為布魯氏菌診斷抗原和藥物治療靶點研究的重點對象(胡劍飛，等.疾病監測,2010(05):380～389；吳朔,等.免疫學雜志,2008(04):385～388)。由于免疫蛋白組學方法可顯示蛋白血清學反應差異信息，并可運用生物信息學技術作為高通量篩選的技術平臺，從膜蛋白中獲取大量可能的鑒別診斷抗原信息，從而破解疫苗免疫與自然感染的難題。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有血清學方法無法區分布魯氏菌疫苗免疫抗體和自然感染抗體難題，提供具有鑒別診斷價值的布魯氏菌基因表達產物，運用免疫學方法，從而實現疫苗免疫抗體及自然感染抗體的鑒別診斷。本專利技術技術方案1.一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2，其特征在于：該產物是由布魯氏菌S2株基因編號(GI)為490823642的基因，表達為“糖苷水解酶家族43(glycosidehydrolasefamily43)”；該基因長度：1068bp；其表達產物的蛋白分子量約37.5kDa，其基因序列為基因序列1。2.本專利技術所述的一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：(1)基因篩選：從布魯氏菌S2株基因組中，通過免疫蛋白組學方法，篩選鑒定出上述權利1的基因；(2)基因表達：通過設計的引物(序列2和序列3)，經過常規PCR克隆擴增，將其置于pGEX6p-1載體中誘導表達；(3)表達產物純化：通過谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱與谷胱甘肽梯度洗脫法純化表達產物，獲得所需抗原，被命名為BLSJ-2。3.本專利技術所述的一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2的應用，其特征在于將該基因PCR克隆擴增，其表達產物作為抗原。該抗原可作為區分動物布魯氏菌疫苗免疫和自然感染血清檢測抗原。本專利技術的詳細描述1.鑒別診斷標識基因的篩選(1)采用免疫蛋白組學技術，選擇我國應用最廣泛的布魯氏菌疫苗株S2和我國布病影響嚴重的羊血清為研究對象，從S2株膜蛋白中篩選出鑒別診斷抗原基因信息。(2)各用30份布病陰性健康羊(Nm)、30份S2免疫羊(Sm)，以及30份臨床布病感染羊陽性混合血清(Zm)，分別與S2株膜蛋白二維電泳膠(2DE)進行免疫印跡(Western-blot)，尋找S2膜蛋白與不同狀態(感染/免疫/陰性)綿羊血清反應差異點，共尋找到113個差異蛋白點。選擇免疫反應差異較大的30個蛋白點進行基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜鑒定及生物信息學分析，共鑒定出14個蛋白。(3)將3種混合血清(感染/免疫/陰性)分別與S2膜蛋白進行免疫共沉淀(IP)，并對IP結合物進行高通量質譜鑒定(Q-Exactive質譜儀)及生物學信息分析，獲得182個候選蛋白點。對2種方法鑒定出的所有蛋白進行功能分析，共挑選出8個體外鑒別診斷的候選靶點。(4)構建8個候選靶蛋白原核表達質粒，將表達蛋白分別與3種混合血清進行免疫印跡(Western-blot)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)，篩選到一個具有鑒別診斷效果的基因(糖苷水解酶家族43，glycosidehydrolasefamily43)鑒別診斷效果明顯。2.基因產物的表達(1)培養繁殖布魯氏菌S2株，提取其基因組。(2)以序列2和序列3分別為上下游引物，按常規PCR方法進行基因擴增，上游引物EcoRI:GAATTC為5’-aaGAATTCatgggtttcagccgcaaac-3’27(序列2)；下游引物XhoI:CTCGAG為5’-atCTCGAGtcattttacggtttccgcaag-3’29(序列3)。(3)基因擴增條帶，經在1％瓊脂糖凝膠電泳中檢測片段與預期的大小一致，并將獲得的重組質粒送公司測序與美國國家生物技術信息中心(NCBI)上公布的基因序列進行比對，符合率為100％。(4)篩選到的陽性重組質粒轉化到商品化的E.coLiBL21(DE3)感受態細胞后，用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其重組蛋白分子量大小分別與理論大小基本一致。3.表達產物的純化(1)誘導表達的蛋白，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定為包涵體。(2)將該包涵體經梯度脲素(4.5M、3.5M、2.5M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M)的透析復性緩沖液于4℃，按常規方法進行梯度透析復性。(3)運用谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白純化柱按其說明書方法進行純化。4.表達產物作為診斷抗原的應用將目的蛋白(糖苷水解酶家族43，glycosidehydrolasefamily43)用谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱純化后獲得的產物命名為BLSJ-2，作為酶聯免疫吸附測定法(ELISA)包被抗原，對30份感染血清及656份免疫羊場血清樣品進行檢測，其建立的酶聯免疫吸附測定法(ELISA)對感染樣本檢出率為87％。附圖說明圖1S2膜蛋白雙相電泳及與不同免疫狀態綿羊血清的免疫印跡(Western-blot)結果圖中：圖A為S2膜蛋白雙相電泳結果，圖B-D依次為膜蛋白分別與布病陰性健康綿羊混合血清(Nm)、S2免疫綿羊混合血清(Sm)、自然感染綿羊混合本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ?2，其特征在于該產物是由布魯氏菌S2株基因編號(GI)為490823642的基因，表達為“糖苷水解酶家族43(glycoside?hydrolase?family?43)”；該基因長度：1068bp；其表達產物的蛋白分子量約37.5kDa。其基因序列為序列1.

【技術特征摘要】
1.一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2，其特征在于該產物是由布魯氏菌S2株基因編號(GI)為490823642的基因，表達為“糖苷水解酶家族43(glycosidehydrolasefamily43)”；該基因長度：1068bp；其表達產物的蛋白分子量約37.5kDa。其基因序列為序列1.2.如權利要求1所述的一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2的制備方法，其特征在于：(1)基因篩選：從布魯氏菌S2株基因組中，通過免疫蛋白組學方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱良全，張磊，王團結，丁家波，馮宇，張閣，彭永，高強，
申請(專利權)人：中國獸醫藥品監察所，
類型：發明
國別省市：北京,11