一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供的一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，其包括：(1)魚樣品取樣及魚體表微生物固定處理；(2)腸道微生物的獲取及菌體的收集；(3)細(xì)胞的包埋與裂解；(4)DNA的提取；(5)DNA保存。試劑盒主要成分：溶液A：為Tris、EDTA的混合溶液；B為Tris、EDTA、NaCl、PVP、異硫氰酸胍、Triton?X100、PMSF、β?巰基乙醇的混合溶液；C為Tris、EDTA、NaCl和DTT的混合溶液；溶液D為蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液；E為Tris飽和酚和氯仿混合液；F為異丙醇；G為乙醇水溶液。本發(fā)明專利技術(shù)得到的DNA片段純度高，宿主及宿主體表微生物DNA含量少。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒
本專利技術(shù)涉及DAN提取領(lǐng)域，尤其涉及一種魚腸道微生物宏基因組文庫構(gòu)建總DNA的提取方法及試劑盒。
技術(shù)介紹
目前傳統(tǒng)的微生物研究手段只能培養(yǎng)0.1％～1％的環(huán)境微生物，這將無法整體分析和利用微生物群落的構(gòu)成和功能。宏基因組文庫技術(shù)可以避開對微生物純培養(yǎng)的限制，直接從環(huán)境中獲得DNA分子，通過測序或者文庫篩選，為人類進(jìn)一步利用微生物資源提供了重要手段。DNA的提取與純化是宏基因組文庫構(gòu)建的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。魚腸道微生物具有非常重要的研究價值，可以用于研究魚類健康和營養(yǎng)代謝、獲得新型酶制劑等。常規(guī)DNA提取主要參照糞便DNA提取法。但是由于在文庫構(gòu)建過程中獲得高純度和高質(zhì)量的DNA，應(yīng)盡量避免魚類體表微生物、魚類腸道組織和食物的污染，同時還要避免魚類消化道消化液對DNA的降解。因而，常規(guī)DNA提取方法滿足不了魚腸道微生物宏基因組文庫構(gòu)建的要求。所以，現(xiàn)有技術(shù)有待于更進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供的一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，在節(jié)約成本的前提下，提取高純度DNA。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)方案包括：一種用于魚腸道微生物宏基因組總DNA提取方法的試劑盒，其包括：溶液A：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，pH8.0；溶液B：100mM/LTris-HCl，20mM/LEDTA,100mM/LNaCl，0.1g/LPVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mMPMSF，1％(v/v)β-巰基乙醇，pH8.5；溶液C：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，0.9％NaCl，5mM/LDTT，pH8.0；溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/LTris-HCl，100mM/LNaCl，0.1％SDS，pH8.0；溶液E：50％Tris-HCl飽和酚(pH8.0),48％氯仿,2％異戊醇；溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；溶液G：異丙醇；溶液H：70％乙醇。使用所述試劑盒之魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法，其包括以下步驟：步驟一，將新鮮的樣品魚擊昏，用吸水紙吸干樣品魚體表液體，用75％的酒精擦拭樣品魚體表面，置于-20℃冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍15-30分鐘；步驟二，使用溶液A配制瓊脂糖凝膠溶液，在保溫箱內(nèi)使其平衡到65℃；步驟三，迅速取出上述步驟一得到的樣品魚，使用步驟二得到的瓊脂糖凝膠溶液涂漬樣品魚體表，對樣品魚體表微生物進(jìn)行固定；冷卻后使用滅菌手術(shù)剪迅速對魚體進(jìn)行解剖，分離得到魚腸道；步驟四，使用無菌過濾器吸取對應(yīng)量的溶液B緩慢注入上述步驟三得到的魚腸道，重復(fù)洗脫3次，將沖洗得到的魚腸道內(nèi)容物收集得到魚腸道內(nèi)容物溶液；步驟五，將上述步驟四得到的魚腸道內(nèi)容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩渦震蕩10-15分鐘，得到懸濁液；步驟六，將8層80目尼龍網(wǎng)紗置于布氏漏斗上，抽濾上述步驟五得到的懸濁液，使用對應(yīng)量的溶液B清洗沉淀物，并收集濾液；步驟七，將步驟六所得的濾液在10000rpm條件下離心10分鐘并收集沉淀，然后用溶液C重懸沉淀，重復(fù)3次，得到下菌體沉淀備用；步驟八，使用溶液A配置濃度為1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，平衡其溫度到45℃；將步驟七得到的菌體沉淀預(yù)熱到45℃后，向其中加入該1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，混合均勻后注入模具，并在4℃下凝固12小時，得到凝膠；步驟九，將步驟八得到的凝膠浸入溶液D中，37℃下恒溫震蕩清洗12小時；步驟十，將清洗后的凝膠放入低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳槽中，使用1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠進(jìn)行封閉，在60v條件下電泳10分鐘，并在紫外燈下迅速切下瓊脂，得到瓊脂糖凝膠；步驟十一，將步驟十切下的瓊脂糖凝膠加入等體積的溶液A后，加熱到65℃融化，并立即加入等體積溶液E，搖晃混勻，在12000rpm條件下離心5分鐘，得到水相；步驟十二，將步驟十一得到的水相移到另一1.5mLEppendorf管中，加入相同體積的溶液F，在12000rpm條件下離心5分鐘，得到相應(yīng)水相，步驟十三，將步驟十二得到的相應(yīng)水相移到另一1.5mLEppendorf管中，加入2倍體積預(yù)冷溶液G，在-80℃條件下靜置沉淀12小時，然后在進(jìn)行10000rpm條件下離心10分鐘；然后向其中加入少量的溶液H重復(fù)洗滌2次，得到DNA沉淀；步驟十四，將步驟十三得到的DNA沉淀在室溫下進(jìn)行干燥，去除酒精對實驗結(jié)果的影響，然后加入相應(yīng)量的溶液A溶解得到相應(yīng)DNA。本專利技術(shù)提供的一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，有效避免了宿主、宿主體表微生物、食物組織DNA的污染，得到的DNA片段沒有RNA、蛋白質(zhì)、多糖、酚類等物質(zhì)的污染，簡化了后期實驗的處理，DNA分子鏈的完整性比常規(guī)方法顯著提升。所獲得的DNA可滿足宏基因組文庫構(gòu)建、宏基因組文庫測序、PCR分析等實驗要求。附圖說明圖1為本專利技術(shù)中提取的小黃魚腸道微生物總DNA的電泳圖；圖2為本專利技術(shù)中使用試劑盒進(jìn)行16S-rRNA基因PCR擴(kuò)增的電泳圖。具體實施方式本專利技術(shù)提供了一種魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法及試劑盒，為使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本專利技術(shù)進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本專利技術(shù)，并不用于限定本專利技術(shù)。本專利技術(shù)提供了一種用于魚腸道微生物宏基因組總DNA提取方法的試劑盒，其包括：溶液A：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，pH8.0；溶液B：100mM/LTris-HCl，20mM/LEDTA,100mM/LNaCl，0.1g/LPVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％(v/v)Triton-X100，0.1mMPMSF，1％(v/v)β-巰基乙醇，pH8.5；溶液C：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，0.9％NaCl，5mM/LDTT，pH8.0；溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/LTris-HCl，100mM/LNaCl，0.1％SDS，pH8.0；溶液E：50％Tris-HCl飽和酚(pH8.0),48％氯仿,2％異戊醇；溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；溶液G：異丙醇；溶液H：70％乙醇。其更為具體的是：溶液A為Tris、EDTA的混合溶液，混合溶液中Tris濃度為100mM/L，EDTA濃度為1mM/L，用鹽酸調(diào)整pH到8.0。溶液B為Tris、EDTA、NaCl、PVP、異硫氰酸胍、PMSF、β-巰基乙醇的混合溶液，混合溶液中Tris濃度為100mM/L，EDTA濃度為20mM/L,NaCl濃度為100mM/L,PVP濃度為0.1g/L，異硫氰酸胍濃度為100mM/L，PMSF濃度為100mM/L，Triton-X100濃度為0.1％(v/v)，β-巰基乙醇濃度為1％(v/v)，用鹽酸調(diào)整pH到8.5。溶液C為Tris、EDTA、NaCl的混合溶液。混合溶液中Tris濃度為100mM/L，EDTA濃度為1mM/L，NaCl濃度為0.9％，DTT濃度為5mM/L，用鹽酸調(diào)整pH到8.0。溶液D為蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液，其中本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于魚腸道微生物宏基因組總DNA提取方法的試劑盒，其包括：溶液A：100mM/L?Tris?HCl，1mM/L?EDTA，pH?8.0；溶液B：100mM/L?Tris?HCl，20mM/L?EDTA,100mM/L?NaCl，0.1g/L?PVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％Triton?X100，0.1mM?PMSF，1％(v/v)β?巰基乙醇，pH?8.5；溶液C：100mM/L?Tris?HCl，1mM/L?EDTA，0.9％NaCl，5mM/L?DTT，pH?8.0；溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L?Tris?HCl，100mM/L?NaCl，0.1％SDS，pH?8.0；溶液E：50％Tris?HCl飽和酚(pH?8.0),48％氯仿,2％異戊醇；溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；溶液G：異丙醇；溶液H：70％乙醇。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于魚腸道微生物宏基因組總DNA提取方法的試劑盒，其包括：溶液A：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，pH8.0；溶液B：100mM/LTris-HCl，20mM/LEDTA,100mM/LNaCl，0.1g/LPVP，100mM/L異硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mMPMSF，1％(v/v)β-巰基乙醇，pH8.5；溶液C：100mM/LTris-HCl，1mM/LEDTA，0.9％NaCl，5mM/LDTT，pH8.0；溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/LTris-HCl，100mM/LNaCl，0.1％SDS，pH8.0；溶液E：50％Tris-HCl飽和酚(pH8.0),48％氯仿,2％異戊醇；溶液F：96％氯仿,4％異戊醇；溶液G：異丙醇；溶液H：70％乙醇。2.一種使用如權(quán)利要求1所述試劑盒之魚腸道微生物宏基因組總DNA的提取方法，其包括以下步驟：步驟一，將新鮮的樣品魚擊昏，用吸水紙吸干樣品魚體表液體，用75％的酒精擦拭樣品魚體表面，置于-20℃冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍15-30分鐘；步驟二，使用溶液A配制瓊脂糖凝膠溶液，在保溫箱內(nèi)使其平衡到65℃；步驟三，迅速取出上述步驟一得到的樣品魚，使用步驟二得到的瓊脂糖凝膠溶液涂漬樣品魚體表，對樣品魚體表微生物進(jìn)行固定；冷卻后使用滅菌手術(shù)剪迅速對魚體進(jìn)行解剖，分離得到魚腸道；步驟四，使用無菌過濾器吸取對應(yīng)量的溶液B緩慢注入上述步驟三得到的魚腸道，重復(fù)洗脫3次，將沖洗得到的魚腸道內(nèi)容物收集得到魚腸道內(nèi)容物溶液；步驟五，將上述步驟四得到的魚腸道內(nèi)容物...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱丹，程凡升，
申請(專利權(quán))人：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：山東,37