一種熒光共振探針及其應用和試劑盒制造技術

本發明專利技術提供了一種熒光共振探針及其應用和試劑盒，屬于生物化學領域。本發明專利技術提供的熒光共振探針，適用于檢測靶核酸片段，其包括能夠與靶核酸片段形成T型結構的第一熒光探針和第二熒光探針，該T型結構可以確保第一熒光探針上的第一熒光基因和第二熒光探針上的第二熒光基因發生熒光共振能量轉移。通過檢測熒光共振能量轉移效率實現對靶核酸片的定性或定量檢測，該熒光共振探針具有較高的特異性和靈敏度，能夠將堿基序列差異程度低至一個堿基的靶核酸片段檢測出。

【技術實現步驟摘要】
一種熒光共振探針及其應用和試劑盒
本專利技術涉及生物化學領域，具體而言，涉及一種熒光共振探針及其應用和試劑盒。
技術介紹
目前，現有的用于檢測微小RNA(miRNA)的方法主要有Northern印跡分析，微點陣分析和實時熒光定量聚合酶鏈式反應。其中，Northern印跡分析是基于雜交檢測RNA的常用方法，它是最早用于微小RNA分析的幾種方法之一。這種方法簡單易行，大部分實驗室都可以進行操作，不需要額外的資金投入與設備更新。微點陣分析也是基于雜交的原理來檢測微小RNA，它通過測定特定過程中微小RNA的表達水平，來分析了解微小RNA的表達調控機制以及由微小RNA調控的基因的表達。微點陣分析采用高密度的熒光標記探針與RNA樣本雜交，通過熒光掃描獲得表達圖譜，借助相應軟件進行miRNA的表達分析。由于在設計探針時可以包含所有可用miRNA序列，因此微點陣可以作到高通量的miRNA分析。實時熒光定量聚合酶鏈式反應通過擴增技術，是指在聚合酶鏈式反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個反應進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。起始目標核酸的拷貝數越高，就越快觀察到熒光強度的顯著增加。但是，上述的現有檢測方法無法清楚的區分出或者準確的檢測出堿基序列差異程度很小(例如只有幾個或一個堿基的差異程度)的miRNA片段或者是其他類型的RNA片段或DNA片段。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種熒光共振探針，該熒光共振探針能夠檢測或區分出堿基序列差異程度很小(例如只有幾個或一個堿基的差異程度)的靶核酸片段，其具有較高的特異性和靈敏度。本專利技術的另一目的在于提供上述熒光共振探針在檢測靶核酸片段中的應用。本專利技術的另一目的在于提供上述熒光共振探針在制備靶核酸片段檢測試劑盒中的應用。本專利技術的另一目的在于提供一種包括上述的熒光共振探針的試劑盒。本專利技術是這樣實現的：一種熒光共振探針，適于檢測靶核酸片段，其包括第一熒光探針和第二熒光探針，第一熒光探針具有第一結合區和第一識別區，第二熒光探針具有第二結合區和第二識別區，第一結合區與第二結合區反向互補，第一結合區的末端標記有第一熒光基團，第二結合區的末端標記有第二熒光基因，第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團的激發光譜重疊，第一識別區和第二識別區分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區反向互補。上述的熒光共振探針在檢測靶核酸片段中的應用。上述的熒光共振探針在制備用于試劑盒中的應用。一種試劑盒，其包括上述的熒光共振探針。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：本專利技術的提供的熒光共振探針包括第一熒光探針和第二熒光探針。第一熒光探針具有與靶核酸片段的第一靶標區反向互補的第一識別區，第二熒光探針具有與靶核酸片段的第二靶標區反向互補的第二識別區。在檢測時，如果待測樣品中存在靶核酸片段，則第一熒光探針的第一識別區和第二熒光探針的第二識別區分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區通過堿基互補配對結合；同時，第一結合區與和第二結合區通過堿基補配對結合。這樣，靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針三者形成一個T型結構，穩定狀態的T型結構能夠使得第一熒光探針上的第一熒光基團和第二熒光探針上的第二熒光基因的距離變短，該距離能夠保證第一熒光基因和第二熒光基團之間發生熒光共振能量轉移。而該T型結構只有在第一識別區和第二識別區與靶核酸片段的相應靶標區的堿基完全互補配對結合的情況下才穩定(只要有一個堿基不能互補配對，T型結構都不穩定，不能保證發生熒光共振能量轉移)。這樣，通過激發第一熒光基因則可檢測到第二熒光基因的熒光發射信號，再根據熒光共振能量轉移效率，實現對堿基序列差異程度很小的靶核酸片段的檢測目的，以及通過對熒光共振能量轉移效率的計算，還可以實現對靶核酸片段的定性或定量檢測。因此，本專利技術提供的熒光共振探針基于一種全新的檢測原理，其不僅能夠實現對靶核酸片段的定性或定量檢測，還能夠將靶核酸片段從數量或類型眾多的且堿基序列差異很小的核酸片段中檢測出來，該堿基序列差異可低至只有一個堿基的差異，具有較高的特異性和靈敏度，并且其可適用于檢測各種類型的DNA和RNA尤其是miRNA，也可適用于制備試劑盒，具有非常廣闊的應用前景和市場價值。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本專利技術的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本專利技術提供的熒光共振探針的檢測原理示意圖；圖2為本專利技術提供的實驗例1的熒光光譜檢測結果圖；圖3為本專利技術提供的實驗例2的熒光共振能量轉移效率檢測結果圖；圖4為本專利技術提供的實驗例3的熒光共振能量轉移效率檢測結果圖。具體實施方式為使本專利技術實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本專利技術提供的一種熒光共振探針及其應用和試劑盒進行具體說明。一方面，本專利技術提供了一種熒光共振探針，其適于檢測核酸片段，其包括第一熒光探針和第二熒光探針。第一熒光探針具有第一結合區和第一識別區。容易理解到，第一結合區和第一識別區相連接。第二熒光探針具有第二結合區和第二識別區。容易理解到，第二結合區和第二識別區相連接。第一結合區與第二結合區反向互補，第一結合區的末端標記有第一熒光基團(也可以理解為第一熒光基因標記在第一結合區遠離第一識別區的一端)，第二結合區的末端標記有第二熒光基因(也可以理解為第二熒光基因標記在第二結合區遠離第二識別區的一端)。第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團的激發光譜重疊。第一識別區和第二識別區分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區反向互補。本專利技術提供的熒光共振探針的檢測原理(如圖1所示)大致如下：首先，第一熒光基因和第二熒光基團各自均具有激發光譜和熒光光譜，且第一熒光基因的熒光光譜與第二熒光基團的激發光譜重疊。當二者的距離足夠靠近時，用第一熒光基因的激發光譜的激發光激發第一熒光基因，第一熒光基團產生的熒光可以激發第二熒光基因產生熒光，則可以檢測到第二熒光基因的熒光發射信號，即發生了熒光共振能量轉移(FRET)，其中，第一熒光基因為熒光共振能量供體，第二熒光基團為熒光共振能量受體。而第一熒光基因和第二熒光基因的之間的距離是熒光共振能量轉移發生的重要因素?；谏鲜鲈?，在檢測時，將第一熒光探針、第二熒光探針以及待測樣品加入到雜交液是進行雜交反應，如果待測樣品中存在靶核酸片段，則第一熒光探針的第一識別區和第二熒光探針的第二識別區分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區通過堿基互補配對結合(第一識別區和第二識別區分別與靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區反向互補)。同時，第一結合區與和第二結合區通過堿基互補配對結合(第一結合區與第二結合區反向互補)。這樣，靶核酸片段、第一熒光探針以及第二熒光探針形成一個T型結構(如圖1所示，圖1中的最右側為形成的T型結構，箭頭代表熒光共振能量的轉移方向)。該T型結構能夠使得第一本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種熒光共振探針，適于檢測靶核酸片段，其特征在于，其包括第一熒光探針和第二熒光探針，所述第一熒光探針具有第一結合區和第一識別區，所述第二熒光探針具有第二結合區和第二識別區，所述第一結合區與所述第二結合區反向互補，所述第一結合區的末端標記有第一熒光基團，所述第二結合區的末端標記有第二熒光基因，所述第一熒光基因的熒光光譜與所述第二熒光基團的激發光譜重疊，所述第一識別區和所述第二識別區分別與所述靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區反向互補。

【技術特征摘要】
1.一種熒光共振探針，適于檢測靶核酸片段，其特征在于，其包括第一熒光探針和第二熒光探針，所述第一熒光探針具有第一結合區和第一識別區，所述第二熒光探針具有第二結合區和第二識別區，所述第一結合區與所述第二結合區反向互補，所述第一結合區的末端標記有第一熒光基團，所述第二結合區的末端標記有第二熒光基因，所述第一熒光基因的熒光光譜與所述第二熒光基團的激發光譜重疊，所述第一識別區和所述第二識別區分別與所述靶核酸片段上相鄰的第一靶標區和第二靶標區反向互補。2.根據權利要求1所述的熒光共振探針，其特征在于，所述第一結合區的長度為7-9bp。3.根據權利要求1所述的熒光共振探針，其特征在于，所述第一識別區的長度為10-12bp，所述第二識別區的長度為10-12bp。4.根據權利要求1-3中任一項所述的熒光共振探針，其特征在于，所述第一熒光基團為Cy3，所述第二熒光基團為Cy5；或者，所述第一熒光基團為Cy5，所述第二熒光基團為Cy5.5；或者，所述第一熒光基團為CFP或GFP，所述第二熒光基團為YFP；或者，所述第一熒光基團為Rluc，所述第二熒光基團為QDs...

【專利技術屬性】
技術研發人員：金宗文，羅擎穎，劉琳，
申請(專利權)人：深圳先進技術研究院，
類型：發明
國別省市：廣東,44