棘球蚴病檢測的血清miRNA生物標志物及其應用制造技術

本發明專利技術公開了血清miRNA組合物，由以下血清miRNAs：emu?miR?10、emu?miR?277組成；并提供了其在制備棘球蚴病檢測制劑中的應用。本發明專利技術的有益效果為：1）血清相對其它組織樣本較容易獲取，來源方便、性能穩定；2）通過實時定量PCR技術對棘球蚴感染的血清miRNAs的檢測，結果可信，方便操作；3）本發明專利技術確定的miRNAs與棘球蚴絳蟲感染密切相關，能夠作為生物標志物對棘球蚴感染進行診斷，為棘球蚴病的診斷提供新思路，具有一定的實用價值。

【技術實現步驟摘要】
棘球蚴病檢測的血清miRNA生物標志物及其應用
本專利技術涉及生物制劑
，具體涉及棘球蚴病檢測的血清miRNA生物標志物及其應用。
技術介紹
多房棘球絳蟲（Echinococcusmultilocularis，Em）在分類上屬于帶科棘球屬，是一種人獸共患寄生性蠕蟲。其幼蟲可寄生于人，引起泡球蚴病（alveolarechinococcosis，AE），該病潛伏期長、不易察覺、病程長、且術后復發率高、難以根治，故有“蟲癌”之稱。在我國西部，如新疆、甘肅、寧夏和青海等，泡球蚴病仍然是一個極其重要的公共衛生問題，它是許多農牧民因病致貧、因病返貧的重要原因，嚴重阻礙著西部經濟發展的步伐。目前，對棘球絳蟲終末宿主感染的檢測診斷及流行病學調查方法，主要包括糞抗原ELISA檢測方法和分子生物學手段的檢測方法，如多種PCR檢測方法、環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)、PCR/斑點雜交技術(PCR/dotblotassay)等。這些方法具有較高的特異性和敏感性，解決了常規檢測方法的一些缺陷如減少污染周圍環境及工作人員的危險等，但只能用于終末宿主的檢測。而中間宿主棘球蚴感染的檢測診斷及流行病學調查主要以剖檢法為主，但這種檢測方法存在一定的問題：需要捕殺大量的野生動物，且存在操作人員遭受感染和污染周圍環境的風險。因此，對中間宿主感染的準確診斷對了解棘球蚴病的流行，以及維護人和動物的公共衛生健康等具有重要作用。miRNAs是近年來發現的一類具有調節基因表達功能的內源性非編碼性小RNA分子，為潛在的分子診斷和藥物靶點。miRNAs在血清中可長期穩定存在，可耐受RNA酶降解、反復凍融。因此，血清miRNAs具備成為一種優良的篩查或診斷的生物標志物的潛質，又具有以蛋白質為代表的傳統生物標志物所不具備的特質，即無需制備抗體且可精確定量，開發應用前景光明。由于血清中miRNAs的表達量較低，尋找一種靈敏度高，操作簡便且成本低廉的檢測方法是目前血清miRNAs應用于寄生蟲感染檢測亟待解決的問題。qRT-PCR是目前檢測血清miRNAs的主要方法。
技術實現思路
本專利技術的目的就是針對上述現有技術的缺陷，提供了棘球蚴病檢測的血清miRNA生物標志物及其應用。為了實現上述目的，本專利技術提供的技術方案為：血清miRNA組合物，由以下血清miRNAs：emu-miR-10、emu-miR-277組成；所述emu-miR-10的序列為：5’-CACCCUGUAGACCCGAGUUUGA-3’；所述emu-miR-277的序列為：5’-UAAAUGCAUUUUCUGGCCCGUAA-3’。本專利技術的第二個目的是提供了用于棘球蚴病檢測的引物組合物，所述引物組合物為上述血清miRNA組合物中各miRNA的檢測引物；各miRNA的反轉錄引物、鎖核酸修飾的特異性引物和通用引物序列如下：其中，下劃線表示鎖核酸修飾（LNATM）的堿基；所述的檢測引物由emu-miR-10和emu-miR-277的miRNA檢測引物組成。本專利技術的第三個目的是提供了上述血清miRNA組合物在制備用于棘球蚴病檢測制劑中的應用。通過加poly(A)尾反轉錄-實時定量PCR方法，可利用棘球蚴病檢測試劑檢測棘球蚴的感染，具體步驟如下：1）血清樣本采集：多房棘球蚴感染的和未感染的小鼠眼球采血，37℃靜置１ｈ后于４℃過夜，以3000r/min離心５min，分離血清，分裝后標記，凍存于-80℃冰箱；2）總RNA提取：取100μL血清用于血清總RNA的提取，提取試劑盒為miRNeasySerum/PlasmaKit；3）cDNA反轉錄：cDNA反轉錄體系包含50ng血清總RNA，5×Reactionbuffer2μL，Enzymemix1μL，Syntheticspike-incontrol(cel-miR-39)0.5μL，加無RNaseH2O至總體積為10μL，加ddH2O進行5倍稀釋，-20℃保存備用；4）實時定量PCR：反應體系包含PCRMastermix10μL，正向特異性引物2μL，稀釋的cDNA模板8μL，反應條件為：95℃10min；95℃10s，60℃1min，共40個循環；72℃延伸3min；反應結束后由配套的計算機軟件計算各反應管內的CT值，分別利用miR-10或miR-227的CT值比外參cel-miR-39的CT值做圖。本專利技術的有益效果為：1）血清相對其它組織樣本較容易獲取，來源方便、性能穩定；2）通過實時定量PCR技術對棘球蚴感染的血清miRNAs的檢測，結果可信，方便操作；3）本專利技術確定的miRNAs與棘球蚴感染密切相關，能夠作為生物標志物對棘球蚴感染進行診斷，為棘球蚴病的診斷提供新思路，具有一定的實用價值。附圖說明圖1顯示為本專利技術的操作流程圖。圖2顯示為emu-miR-10和emu-miR-227在對照小鼠血清和多房棘球蚴感染小鼠血清中的相對表達量。具體實施方式實施例1：從保種DBA/2小鼠腹腔無菌取泡球蚴組織，剪碎，過篩，用生理鹽水漂洗５次，棄上清液，取沉淀物。用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水配成含2000個原頭蚴/mL懸液。血清的收集：30只4～6周齡雌性DBA/2小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，隨機分為感染組和對照組。感染組每只小鼠左下腹腔注射0.5mL原頭蚴懸液，對照組每只小鼠左下腹腔注射0.5mL生理鹽水。感染4周后眼球采血，37℃靜置１ｈ后于４℃條件下，以3000r/min離心５min，分離血清分裝后標記，凍存于-80℃冰箱。采血后處死，檢測小鼠的感染狀況。血清樣本總RNA的提取：參照Qiagen公司商品化的總RNA提取試劑盒miRNeasySerum/PlasmaKit說明書提取各組血清樣本的總RNA，NANODROP2000測量血清RNA的濃度，將提取的RNA置于-80℃保存。具體操作步驟如下：1)取100μL血清置于一個無RNase的1.5mL離心管中，加入500μLQIAzolLysisReagent，上下顛倒混勻，室溫靜置5min。2)加入100μL的氯仿，上下顛倒混勻15s，室溫靜置3min。12000×g離心。3)吸取上清于一個新的無RNase離心管，加入1.5倍上清體積的無水乙醇，顛倒混勻。4)吸取上清700μL加入RNeasyMinElutespincolumn中，室溫8000×g離心15s。5)加入700μLbufferRWT洗滌，8000×g離心15s。棄濾液，重復洗滌一次。6)加入500μLBufferRPE洗滌，8000×g離心15s，棄濾液；再加入500μL的80%乙醇洗滌，8000×g離心2min，棄濾液。7)加入15μL的無RNase水，靜置5min,8000×g離心1min，即為RNA提取液。反轉錄合成cDNA：根據EXIQON公司商品化的miRCURYLNATMUniversalRTmicroRNAPCR試劑盒說明書，在無RNA酶的0.2mLPCR管中依次加入5×Reactionbuffer2μL，Enzymemix1μL，Syntheticspike-incontrol(cel-miR-39)0.5μL，總RNA5μL（預先將每個樣本的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
血清miRNA組合物，其特征在于，由以下血清miRNAs：emu?miR?10、emu?miR?277組成；所述emu?miR?10的序列為：5’?CACCCUGUAGACCCGAGUUUGA?3’；所述emu?miR?277的序列為：5’?UAAAUGCAUUUUCUGGCCCGUAA?3’。

【技術特征摘要】
1.血清miRNA組合物，其特征在于，由以下血清miRNAs：emu-miR-10、emu-miR-277組成；所述emu-miR-10的序列為：5’-CACCCUGUAGACCCGAGUUUGA-3’；所述emu-miR-277的序列為：5’-UAAAUGCAUUUUCUGGCCCGUAA-3’。2.用于棘球蚴感染檢測的引物...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭小臘，鄭亞東，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：甘肅,62