表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)及其應(yīng)用技術(shù)方案

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)所述的表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)包括西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒以及穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C?prM?E蛋白的重組細(xì)胞系。使用本發(fā)明專利技術(shù)的系統(tǒng)獲得的限制性復(fù)制西尼羅病毒(△WNV)，該病毒在BWNV?CME細(xì)胞系中具有與WNV全病毒相似的特性，且可以表達(dá)GFP，具有可視化效果，更重要的是，該病毒只能在本系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，感染其他細(xì)胞時(shí)則不能產(chǎn)生仔代病毒，因此具有極高的安全性，可用于WNV中和抗體檢測(cè)以及抗病毒藥物篩選。本發(fā)明專利技術(shù)的提出提高了WNV相關(guān)操作的安全性與簡(jiǎn)便性，不依賴于BSL?3高等級(jí)生物安全條件，為WNV疫苗評(píng)價(jià)、抗病毒藥物篩選及病毒致病機(jī)制研究提供了良好的技術(shù)手段。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及一種病毒復(fù)制系統(tǒng)及其應(yīng)用，特別涉及一種表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)及其應(yīng)用，本專利技術(shù)屬于生物

技術(shù)介紹
西尼羅病毒(WestNileVirus，WNV)屬黃病毒科，黃病毒屬，是一種重要的人獸共患傳染病病毒，能引起人嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。WNV病毒顆粒直徑約40nm～60nm，有囊膜，膜內(nèi)的病毒核衣殼呈二十面體對(duì)稱，直徑約30nm。WNV基因組為一條單鏈正義RNA，長(zhǎng)約11kb。基因組由5’端長(zhǎng)96nt和3’端長(zhǎng)337-649nt的非編碼區(qū)(UTR)及一個(gè)長(zhǎng)約10.3kb的單一開放閱讀框(openreadingframe,ORF)構(gòu)成。ORF從5’端97位起始，至3’端10398位終止，編碼1個(gè)全長(zhǎng)為3433個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，經(jīng)宿主和病毒蛋白酶的切割加工后產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白：C蛋白(衣殼/核心蛋白)、prM/M(膜前體蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白。西尼羅病毒病是由西尼羅病毒引起的傳染病，是一種人獸共患病。該病對(duì)我國(guó)來說是外來病，目前在中國(guó)內(nèi)地還未見報(bào)道，但中國(guó)的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜，蚊蟲種類繁多，具備傳播條件，且俄羅斯、印度等周邊國(guó)家已有該病的流行，隨著國(guó)際交流的日益頻繁，WNV傳入中國(guó)境內(nèi)的可能性不容忽視，如近年來已經(jīng)從新疆的蚊中分離出了WNV的報(bào)道。所以對(duì)我國(guó)而言，WNV流行爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)非常大，且目前還沒有疫苗或有效的藥物來預(yù)防和治療感染西尼羅河病毒，所以有必要研究相應(yīng)預(yù)防控制措施。但WNV是人獸共患性病原，疫苗等相關(guān)研究的活病毒操作需要在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，這在一定程度上阻礙了相關(guān)疫苗與藥物研究。為了促進(jìn)WNV疫苗研制以及篩選新抗病毒藥物，本專利技術(shù)構(gòu)建了缺失全部結(jié)構(gòu)蛋白的全病毒基因組，并在其結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域插入GFP報(bào)告基因的WNV復(fù)制子質(zhì)粒pWNVrepGFP-dCME，以及構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)C-prM-E蛋白的細(xì)胞系；復(fù)制子質(zhì)粒、重組細(xì)胞系與包裝的△WNV病毒構(gòu)成了一個(gè)限制性復(fù)制的西尼羅病毒系統(tǒng)。本專利技術(shù)的復(fù)制缺陷型西尼羅病毒系統(tǒng)可為西尼羅病毒的流行病學(xué)調(diào)查、疫苗評(píng)價(jià)、抗病毒藥物篩選和西尼羅河病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)理的研究提供安全、簡(jiǎn)便的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種表達(dá)綠色熒光蛋白且只能在系統(tǒng)內(nèi)具有感染性與復(fù)制能力的西尼羅病毒(WNV)制備系統(tǒng)，以應(yīng)用于安全、可視化的、類似于全病毒感染與復(fù)制的WNV中和抗體檢測(cè)系統(tǒng)及藥物篩選方法。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)手段：本專利技術(shù)的一種表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)，包括：(1)西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒：所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒是通過將西尼羅病毒基因組克隆到真核表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游，并同時(shí)將基因組中的結(jié)構(gòu)蛋白C-prM-E序列替換為綠色熒光蛋白基因后得到的；(2)穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系所述的重組細(xì)胞系是通過將含有西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后得到的。在本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建中，所采用的真核表達(dá)載體為pCI-neo。在本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系是將含有優(yōu)化后的西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后得到的，更優(yōu)選的，所述的真核表達(dá)載體為pCAG-neo，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞。在本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述的優(yōu)化后的西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系是通過以下方法構(gòu)建得到的：(1)人工合成優(yōu)化后的C-prM-E蛋白表達(dá)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，優(yōu)化后的序列命名為opti-WNV-CME，進(jìn)行人工合成后通過PCR方法擴(kuò)增優(yōu)化后的序列，并在PCR產(chǎn)物的5′端引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，3′端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，雙酶切后的PCR產(chǎn)物與同樣雙酶切的pCAG-neo載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5а后，挑選重組克隆、經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得陽性克隆后用試劑盒大量制備質(zhì)粒，命名為pCAG-WNV-CME，用SspI進(jìn)行線性化后凍存于-20℃?zhèn)溆茫?2)選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞消化傳代至24孔板中，待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿時(shí)，用線性化后的重組質(zhì)粒pCAG-WNV-CME轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系，命名為BWNV-CME。進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提出了所述的系統(tǒng)在獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒中的用途。更進(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提出了一種獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒的方法，包括以下步驟：以含有10％(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，1：4傳代培養(yǎng)本專利技術(shù)所述的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的重組細(xì)胞以5×105/ml接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)，將本專利技術(shù)所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒加入Opti-MEM中制成DNA稀釋液，每3μg質(zhì)粒加入200μlopti-MEM，加入20μlX-tremeHP轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置15min，將DNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物逐滴加入含有穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞的培養(yǎng)液中，72h后觀察熒光。收取上清，離心過濾后儲(chǔ)存于－80℃?zhèn)溆谩Ｔ龠M(jìn)一步的，本專利技術(shù)還提出了按照所述的方法獲得的表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒以及所述的表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒在制備西尼羅病毒中和抗體檢測(cè)試劑以及篩選抗西尼羅病毒藥物中的用途。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果在于：本專利技術(shù)研制成的WNV復(fù)制缺陷型病毒是利用缺失結(jié)構(gòu)蛋白基因的基因組復(fù)制子轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)WNVC-prM-E蛋白的細(xì)胞系BWNV-CME進(jìn)行△WNV病毒粒子包裝，該病毒基因組中的結(jié)構(gòu)蛋白基因被表達(dá)綠色熒光蛋白的基因所取代，因此在病毒復(fù)制子復(fù)制過程中，由于其不能自身表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白而無法繼續(xù)產(chǎn)生子代病毒，但可以大量表達(dá)GFP蛋白，對(duì)感染細(xì)胞具有極強(qiáng)的指示作用。而只有當(dāng)與外源提供的WNVC蛋白(衣殼/核心蛋白)、prM/M(膜前體蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)重新裝配后才能夠整合成完整的病毒粒子。在復(fù)制缺陷型病毒中和試驗(yàn)中，WNV復(fù)制缺陷型病毒能被中和抗體有效中和而失去對(duì)宿主細(xì)胞的感染作用。因?yàn)閃NV復(fù)制缺陷型病毒含有報(bào)告基因，能夠表達(dá)綠色熒光蛋白，因此可以利用熒光顯微鏡直觀的觀測(cè)到被病毒感染的細(xì)胞。使用WNV復(fù)制缺陷型病毒代替野生型WNV進(jìn)行中和抗體的檢測(cè)時(shí)，只需將一定劑量的復(fù)制缺陷型病毒同待檢樣品共同孵育1h后，直接感染易感細(xì)胞BHK-21，48h后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀測(cè)熒光密度，用來評(píng)價(jià)待檢樣品中的中和抗體，該操作相較于活病毒操作具有極高的安全性與簡(jiǎn)便性，不依賴于BSL-3高等級(jí)生物安全條件，節(jié)省時(shí)間，提高效率。同時(shí)因?yàn)閃NV復(fù)制缺陷型病毒是復(fù)制缺陷型的，因此所加入的病毒量是個(gè)固定的數(shù)值，不會(huì)因感染易感細(xì)胞而本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)，其特征在于包括：(1)西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒：所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒是通過將西尼羅病毒基因組克隆到真核表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游，并同時(shí)將基因組中的結(jié)構(gòu)蛋白C?prM?E序列替換為綠色熒光蛋白基因后得到的；(2)穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C?prM?E蛋白的重組細(xì)胞系所述的重組細(xì)胞系是通過將含有西尼羅病毒C?prM?E蛋白表達(dá)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后得到的。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達(dá)綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒系統(tǒng)，其特征在于包括：(1)西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒：所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒是通過將西尼羅病毒基因組克隆到真核表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游，并同時(shí)將基因組中的結(jié)構(gòu)蛋白C-prM-E序列替換為綠色熒光蛋白基因后得到的；(2)穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系所述的重組細(xì)胞系是通過將含有西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后得到的。2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建中，所采用的真核表達(dá)載體為pCI-neo。3.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的西尼羅病毒限制性復(fù)制子質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系是將含有優(yōu)化后的西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后得到的，優(yōu)選的，所述的真核表達(dá)載體為pCAG-neo，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞。5.如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的優(yōu)化后的西尼羅病毒C-prM-E蛋白表達(dá)基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒C-prM-E蛋白的重組細(xì)胞系是通過以下方法構(gòu)建得到的：(1)人工合成優(yōu)化后的C-prM-E蛋白表達(dá)基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，優(yōu)化后的序列命名為opti-WNV-CME，進(jìn)行人工合成后通過PCR方法擴(kuò)增優(yōu)化后的序列，并在PCR產(chǎn)物的5′端引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，3′端引入XhoⅠ酶...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：華榮虹，步志高，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：黑龍江,23