一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b，該基因的cDNA核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了所述基因及含有該基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300?GhNPC3b?EPSP在提高棉花抗逆性中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明專利技術(shù)所述基因的表達(dá)受低磷、干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因棉花實(shí)驗(yàn)顯示可以顯著提高轉(zhuǎn)基因棉花的抗逆特性。預(yù)示GhNPC3b基因應(yīng)用于培育抗逆轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有極大的潛力。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b及其在提高棉花抗逆性中的應(yīng)用。屬于植物基因工程領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
棉花是世界上最重要的天然纖維，干旱、低磷等非生物脅迫影響棉花的生長，最終導(dǎo)致棉花產(chǎn)量降低。在耕地面積只減不增的情況下，一些地方出現(xiàn)了糧棉爭地的現(xiàn)象。在人類文明發(fā)展的長河中，穿衣和吃飯同等重要。解決糧棉爭地的最好辦法是培育抗逆性較強(qiáng)的優(yōu)良棉花品種，及高效開發(fā)利用干旱區(qū)、鹽堿地或土壤貧瘠化土地。非特異性磷脂酶C，主要以磷脂酰膽堿為底物，生成二酰甘油和磷酸膽堿。擬南芥中，非特異性磷脂酶C基因家族有6個成員(Nakamuraetal.2005)。2005年至今，相繼有文獻(xiàn)報導(dǎo)植物非特異性磷脂酶C參與植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗逆過程(Nakamuraetal.2005；Petersetal.2010；Wimalasekeraetal.2010；Kocourkovaetal.2011；Pokotyloetal.2013；Nakamura2014；Petersetal.2014；etal.2015；Pejcharetal.2015；Hongetal.2016)。然而，研究對象大多是模式生物擬南芥，其他物種中非特異性磷脂酶C的功能研究甚少。為了更好地了解植物非特異性磷脂酶C的功能，對棉花非特異性磷脂酶C基因家族進(jìn)行研究是非常必要的，但檢索發(fā)現(xiàn)迄今為止，沒有任何棉花非特異性磷脂酶C的相關(guān)報導(dǎo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的是提供一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b及其在提高棉花抗逆性中的應(yīng)用。本專利技術(shù)所述的陸地棉非特異性磷脂酶C基因，其特征在于：該基因命名為陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b，該基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本專利技術(shù)首次克隆出陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b，實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)：GhNPC3b基因定位在D13染色體上，氨基酸的數(shù)目為305，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子。MEME分析發(fā)現(xiàn)，GhNPC3b有8個motif。對得到的motif進(jìn)一步去ExPASy中分析，發(fā)現(xiàn)有3個motif注釋為磷酸酯結(jié)構(gòu)域。用NCBIConservedDomainsearch和SMART在線分析GhNPC3b的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)GhNPC3b含有磷酸酯結(jié)構(gòu)域。對GhNPC3b進(jìn)行啟動子順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)GhNPC3b的啟動子中含有與脅迫相關(guān)或激素相關(guān)的順式作用元件。如HSE(熱脅迫相關(guān))，TC-richrepeats(防御與脅迫相關(guān))，ARE(厭氧誘導(dǎo)相關(guān))，ABRE(脫落酸相關(guān))，TGACG-motif和CGTCA-motif(茉莉酮酸甲酯相關(guān))。對GhNPC3b進(jìn)行不同器官的表達(dá)譜分析，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，GhNPC3b主要在根中表達(dá)。對四葉期棉花分別進(jìn)行低磷(5μM)、鹽(200mMNaCl)、干旱(20％PEG6000)和ABA(200μM)的脅迫處理，分別在處理0，1，2，3，6，9和12h時進(jìn)行取材，取材部位為根部。提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，低磷脅迫1h時，GhNPC3b表達(dá)水平上調(diào)，但是處理1h后表達(dá)水平下調(diào)；鹽脅迫下，GhNPC3b表達(dá)水平下調(diào)；干旱脅迫處理1h和2h時表達(dá)水平分別上調(diào)5.9和3.0倍，隨之表達(dá)水平表現(xiàn)出輕微下調(diào)的現(xiàn)象。ABA脅迫處理1h時，GhNPC3b表達(dá)水平上調(diào)3.4倍，處理1h后表達(dá)水平與0h相比差異不顯著。GhNPC3b基因的表達(dá)受低磷、干旱和ABA的脅迫誘導(dǎo)。本專利技術(shù)還提供了一種含有上述陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。本專利技術(shù)所述陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b在提高棉花抗逆性中的應(yīng)用。本專利技術(shù)所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP在提高棉花抗逆性中的應(yīng)用。其中：所述抗逆性是指抗旱和/或耐低磷。所述棉花品種是春棉、夏棉、常規(guī)棉或雜交棉。在構(gòu)建GhNPC3b過表達(dá)結(jié)構(gòu)時，將GhNPC3b的cDNA核苷酸序列插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP中，獲得質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。酶切鑒定正確后，將質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤農(nóng)桿菌AGL1或LBA4404中，用于植物遺傳轉(zhuǎn)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，以棉花的莖尖分生組織細(xì)胞為受體將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞中，即獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過分子檢測和植株抗逆性測定選出目的基因穩(wěn)定表達(dá)且植株抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。通過盆栽試驗(yàn)和大田抗逆性測定試驗(yàn)，即可篩選出抗逆性明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料。獲得的優(yōu)異材料有望用于棉花育種或生產(chǎn)實(shí)踐。本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)首次從陸地棉中克隆出非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b。該基因的表達(dá)受低磷、干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)。同時本專利技術(shù)成功構(gòu)建了pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP植物表達(dá)載體，將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到棉花中證實(shí)，本專利技術(shù)所述基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因棉花的抗逆特性。預(yù)示，GhNPC3b基因應(yīng)用于培育抗逆轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有極大的潛力。附圖說明圖1：質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP的的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2：GhNPC3b基因組織特異性分析其中：TR，主根；LR，側(cè)根；SM，莖；CL，子葉；SL，衰老葉片；EL，幼嫩葉片；ST，莖尖；BR，苞片；PE，花瓣；OV，胚珠。圖3：GhNPC3b基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析。具體實(shí)施方式以下敘述本專利技術(shù)的實(shí)施例。需說明的是，本專利技術(shù)的實(shí)施例只對本專利技術(shù)起說明作用而沒有限制作用。如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1.高保真PCR擴(kuò)增GhNPC3b目的基因取陸地棉中9807四葉期幼嫩的葉片和根，參照植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)說明書，提取植物總RNA，用PrimeScriptRTReagentKit(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以特異引物進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。特異引物序列如下：GhNPC3b-F：GGGGTACCATGGTTTCATTAATTAATATGhNPC3b-R：CGAGCTCTCAACGATCACAAACCAAAPCR反應(yīng)總體積為25μL，反應(yīng)體系為：5μL5×PSBuffer，2μLdNTP，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，0.25μLPrimeSTARase，1μL稀釋十倍的cDNA模板，ddH2O補(bǔ)齊至25μL。PCR擴(kuò)增條件，預(yù)變性95℃3min，35個循環(huán)：98℃，10sec；56℃，5sec；72℃，90sec，最后72℃延伸6min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收(TIANGEN，北京)純化后，連接到pEASY-BluntCloningvector(TRANSGEN，北京)上。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransT1(TRANSGEN，北京)，進(jìn)行測序分析。通過上述步驟，獲得了陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b的cDNA核苷酸序本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名為陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b，該基因的cDNA核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種陸地棉非特異性磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名為陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b，該基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一種含有權(quán)利要求1所述陸地棉非特異性磷脂酶C基因GhNPC3b的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。3.權(quán)利...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張可煒，宋玖玲，郭志強(qiáng)，程成，李坤朋，張尚立，
申請(專利權(quán))人：山東大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：山東,37