一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術(shù)方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結(jié)合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內(nèi)特異性聚集及胞內(nèi)侵襲的特性，攜帶細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本發(fā)明專利技術(shù)首先構(gòu)建了Abvec?Igk?Aif、Abvec?Igk?T18?Aif重組質(zhì)粒，經(jīng)擴增后通過電擊轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，利用減毒鼠傷寒沙門氏菌胞內(nèi)侵襲的特性，以HEK293?T細(xì)胞為宿主實現(xiàn)蛋白的表達，最后利用含青霉素、鏈霉素的血清培養(yǎng)基殺死細(xì)胞內(nèi)外的減毒鼠傷寒沙門氏菌，使重組質(zhì)粒釋放至真核細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，該上清液即屬于本發(fā)明專利技術(shù)所述藥物的一種存在形式。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)
，進一涉及基因重組與轉(zhuǎn)染方法的研究，同時涉及目的蛋白的表達及其功能驗證，具體涉及一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法。
技術(shù)介紹
細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosisinducingfactor，AIF)，是一類存在于線粒體內(nèi)外膜之間的保守的黃素蛋白，可誘導(dǎo)Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的長度為2.4kb，編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)有三個不同長度的可變剪接體，它們的氨基酸數(shù)分別為613、609和326。除可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，AIF兼具氧化還原酶的活性。當(dāng)細(xì)胞受到特定的凋亡誘導(dǎo)信號的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道(mitochondrialpermeabilitytransitionpores，MPTP)打開，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并進入細(xì)胞核中，和另一個線粒體蛋白endonucleaseG(EndoG)一起，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂成50kb大小的片段在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程時，AIF有兩個方面的作用：一是可以作為細(xì)胞凋亡的起始因子，二是可以作為細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)因子。在正常的情況下，AIF存在于線粒體中，可以清除細(xì)胞內(nèi)的自由基從而阻止細(xì)胞凋亡；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后。AIF首先從線粒體出來，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，最后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的作用。內(nèi)皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一個被糖基化修飾的80.9KDa的蛋白核心區(qū)組成，修飾后成熟的糖蛋白大約在175KDa。TEM1是近期發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤標(biāo)記物之一，其對腫瘤的細(xì)胞生長血管生成浸潤及轉(zhuǎn)移有重要作用。TEM1外部分由五個球狀結(jié)構(gòu)域(N端的C型凝集素結(jié)構(gòu)域，壽司樣結(jié)構(gòu)域，和三個表皮生長因子(EGF)樣重復(fù))和一個粘蛋白樣區(qū)組成，其中核心蛋白大量唾液酸化與血栓調(diào)節(jié)蛋白相似。對于成體組織，TEM1的表達分布是這樣的：子宮>腎小球>輸卵管血管>心和肺>其他組織；另外，在內(nèi)皮祖細(xì)胞中TEM1表達量相對很少。然而，在以下腫瘤中TEM1都有高表達，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結(jié)腸癌，且實驗表明在卵巢癌中，TEM1表達與腫瘤的浸潤、預(yù)后密切相關(guān)。因此，TEM1在正常組織不表達或者低表達，而在腫瘤血管組織高表達的特點，預(yù)示了TEM1作為腫瘤診斷和治療的靶標(biāo)分子的潛力。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中天然結(jié)構(gòu)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子AIF對腫瘤細(xì)胞的攻擊缺乏靶向作用。本專利技術(shù)要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種AIF與抗體偶聯(lián)的靶向抗腫瘤藥物。本專利技術(shù)要解決的再一技術(shù)問題是在獲得了整合有AIF-單鏈抗體復(fù)合物的表達基因的重組質(zhì)粒的情況下，現(xiàn)有技術(shù)中對此類質(zhì)粒的表達方法操作繁瑣、蛋白表達水平較低。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表達基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coliTop10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。作為優(yōu)選，所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。作為優(yōu)選，所述AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。作為優(yōu)選，步驟1)所述酶切方式是經(jīng)AgeI和BsiwI雙酶切，對酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質(zhì)粒中。作為優(yōu)選，步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；B)挑取單菌落接種于3～7mlLB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。作為優(yōu)選，HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細(xì)胞與載體菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。作為優(yōu)選，所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。在以上技術(shù)方案中，所述Abvec-Igk質(zhì)粒明確限定為：NCBIGenBank中編號為FJ475056的質(zhì)粒，該質(zhì)粒的基因序列如SEQIDNo.3所示。因此本專利技術(shù)中所述Abvec-Igk質(zhì)粒不具有其他指向作用或概況作用。在以上技術(shù)方案中，所述T18是一種特異性識別TEM1的單鏈抗體，該抗體的名稱(即T18)屬于自創(chuàng)詞匯。所述T18-Aif表達基因是指整合有Aif表達基因的重組單鏈抗體T18的表達基因。作為一種自創(chuàng)詞匯，T18-Aif表達基因的技術(shù)特征是由序列如SEQIDNo.1所示的DNA表征的；在知曉該具體序列的情況下，T18-Aif表達基因可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)的DNA合成方法獲得，當(dāng)然也可以利用以上優(yōu)選技術(shù)方案中所披露的PCR方法獲得。本專利技術(shù)提供了一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術(shù)方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結(jié)合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內(nèi)特異性聚集及胞內(nèi)侵襲的特性，攜帶細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本專利技術(shù)首先構(gòu)建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)取序列如SEQ?ID?No.1所示的T18?AIF表達基因、序列如SEQ?ID?No.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec?Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif，在宿主細(xì)胞E.coli?Top10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec?Igk?T18?Aif、Abvec?Igk?Aif，分別通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec?Igk?T18?Aif?VNP20009和Abvec?Igk?Aif?VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；4)取HEK293?T細(xì)胞與載體菌株Abvec?Igk?T18?Aif?VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293?T細(xì)胞與載體菌株Abvec?Igk?Aif?VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-AIF表達基因、序列如SEQIDNo.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec-Igk質(zhì)粒連接，分別得到重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；2)分別取步驟1)所得重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細(xì)胞E.coliTop10中進行質(zhì)粒擴增；3)分別收集步驟2)擴增后的重組質(zhì)粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉(zhuǎn)法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms；4)取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細(xì)胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細(xì)胞量為1:80～1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細(xì)胞收集上清。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌和抗體結(jié)合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，其特征在于所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。3.根...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳廷濤，辛洪波，王鑫，
申請(專利權(quán))人：南昌大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江西,36