一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應用，制備步驟為：制備海帶雌配子體細胞團；質粒pBA002?Bar的DNA的提取；海帶雌配子體細胞團的轟擊；共培養與基因轉化；抗除草劑海帶孢子體的獲得；此外還包括利用抗除草劑海帶孢子體培育抗除草劑的海帶幼小種苗。通過本發明專利技術獲得了具有抗除草劑的海帶孢子體細胞，進一步培養獲得了穩定發育的、具有抗除草劑基因的幼小種苗。本發明專利技術可以保持海帶孢子體細胞無性繁殖的遺傳穩定性。

【技術實現步驟摘要】
一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應用
本專利技術涉及一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應用，具體涉及將抗除草劑的Bar基因導入海帶雌配子體中，并以此為親本培育雌雄配子體，獲得抗除草劑的孢子體細胞，再經過30天的連續低溫培養，獲得抗除草劑的海帶幼小種苗。本專利技術屬于生物

技術介紹
海帶(L.japonica)屬于褐藻門，是多年生的大型藻類，山東省沿海地區的海帶養殖面積達20多萬畝，年產鮮海帶200多萬噸，占全國的90％。海帶中含有多種藥用活性成分，清淤化痰、降血脂，其多種成分具有抗癌抗病毒的藥理作用。在人工條件下用充氣懸浮培養的海帶雌配子體細胞，生長極快，生物量每周可翻一番，一個月的生物量可提高20倍。抗除草劑的Bar基因(BialaphosResistanceGene)來源于吸水鏈霉菌，編碼了一種PAT蛋白，共183個氨基酸。該蛋白能夠使草丁膦氨基乙酰化，從而使草丁膦失去對植物的毒性。該蛋白不含有糖基化的氨基酸位點，沒有過敏源，不會引起人體的過敏性反應。因此它的使用是非常安全的。使用Bar基因轉化獲得的轉基因植物有玉米、棉花、煙草、小麥、馬鈴薯、油菜、白楊樹等植物。美國、巴西和墨西哥種植的轉基因大豆基本上都是利用Bar基因表達的抗除草劑特性，并進行大面積種植，我國每年進口8000萬噸以上含有Bar基因的轉基因大豆。抗除草劑海帶孢子體細胞培育的方法是以海帶雌雄配子體細胞培養形成可用于種苗的幼小孢子體的種苗培育技術，對于加速海帶新品種培育、配子體細胞的大規模生產、以及孢子體人工種苗的培育都應用具有重要價值。
技術實現思路
本專利技術提供了一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應用，本專利技術以轉化抗除草劑基因Bar獲得的雌配子體細胞與同型非轉化體雄配子體細胞融合形成雜交孢子體細胞，將雜交孢子體細胞連續低溫培養，獲得抗除草劑的孢子體幼胚，并形成幼小孢子體種苗。本專利技術的
技術實現思路
主要為：(1)抗除草劑基因Bar在海帶雌配子體細胞內的轉化；(2)抗除草劑海帶雌雄配子體細胞的共培養及抗除草劑孢子體細胞的培育；3)抗除草劑海帶幼小種苗的培養。本專利技術的具體技術方案如下：抗除草劑海帶孢子體的制備方法，具體步驟如下：(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號(來源于中國科學院海洋研究所藻類生物學實驗室)海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在5×105-2×106個/mL(用血球計數板計數)，轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈；優選的，選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在1×106個/mL。(2)轉化載體的來源和質粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取試劑盒提取質粒pBA002-Bar(在載體pBA002中導入長度為552bp的Bar基因的重組質粒)的DNA，用以基因槍轟擊后的共培養和目標基因的轉化；在pBA002載體中的Bar基因大小有552bp，編碼183個氨基酸，Bar基因的核苷酸序列為SEQIDNo.1，氨基酸序列為SEQIDNo.2，經過重組后被插入到Nos啟動子之后、E9終止子之前的EcoRI和BglII位點上。(3)基因槍操作技術過程：擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；(4)共培養與基因轉化：向轟擊后的品系13號的雌配子體細胞加入步驟(2)中提取的質粒pBA002-Bar的DNA，在11-13℃條件下共培養48小時；然后加入質量濃度為40mg/L的草丁膦，連續培養三周，篩選出轉化的雌配子體細胞，即抗除草劑的雌配子體。經過40mg/L草丁膦篩選的雌配子體細胞呈褐色，非轉化細胞不抗除草劑呈綠色，并漸漸分離成單細胞而死亡。優選的，向轟擊后的品系13號的雌配子體細胞加入步驟(2)中提取的質粒pBA002-Bar的DNA，在12℃條件下共培養48小時。(5)抗除草劑海帶孢子體的獲得：將抗除草劑的雌配子體與同型非轉化體雄配子體細胞進行共培養獲得交雜孢子體細胞，經過連續11-13℃低溫條件培養，精子和配子體的卵細胞自然融合產生的大量抗除草劑的孢子體幼胚；優選的，將抗除草劑的雌配子體與同型非轉化體雄配子體細胞進行共培養獲得交雜孢子體細胞，經過連續12℃低溫條件培養。抗除草劑海帶孢子體共培養和低溫培養的營養液的組成：滅菌海水中添加NaNO3和KH2PO4，滅菌海水中NaNO3的終濃度為8-12mg/L，滅菌海水中KH2PO4的終濃度為0.8-1.1mg/L；抗除草劑的海帶孢子體細胞經過15天的細胞分裂和生產發育長成8-10列細胞的孢子體，經過30天后可以形成26-32列幼小種苗，并長有附著器。優選的，滅菌海水中NaNO3的終濃度為10mg/L，滅菌海水中KH2PO4的終濃度為1.0mg/L。本專利技術中，抗除草劑的海帶幼小種苗的培育(1)將抗除草劑的孢子體幼胚置于培養液中進行培養；培養液的組成為：滅菌海水中添加NaNO3和KH2PO4，滅菌海水中NaNO3的終濃度為8-12mg/L，NaNO3與KH2PO4的質量比為10:0.8-1.1；培養條件為每兩天更換一次培養液，11-12℃低溫光照培養箱培養，光照強度為800Lux，培養8-10天，光照培養與暗培養的時間比例為14小時：10小時；優選的，滅菌海水中NaNO3的終濃度為10mg/L；NaNO3與KH2PO4的質量比為10:1。(2)對抗除草劑的海帶幼小種苗進行培養，同時進行PCR檢測，實施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度條件下的除草劑篩選，測試轉化的幼小種苗對除草劑草丁膦的耐性，建立完整的海帶抗除草劑孢子體細胞無性繁殖體系。本專利技術中除特殊說明外，“％”均表示質量濃度。本專利技術與現有技術相比具有以下優點：通過本專利技術的技術手段，獲得了具有抗除草劑的海帶孢子體細胞，進一步培養獲得了穩定發育的、具有抗除草劑基因的幼小種苗。本專利技術可以保持海帶孢子體細胞無性繁殖的遺傳穩定性。附圖說明圖1為抗除草劑、呈褐色的海帶雌配子體細胞，以及不抗除草劑、呈綠色死亡的海帶雌配子體細胞圖；圖2為抗除草劑的海帶孢子體細胞(左)；以及表達抗除草劑基因的海帶孢子體幼小種苗及其附著器(右)；圖3為經過PCR驗證的海帶孢子體中的Bar基因；圖4為帶有附著體的孢子體細胞圖；圖5為抗除草劑的海帶幼小種苗圖。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本專利技術，本專利技術的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本專利技術的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神和范圍下可以對本專利技術技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術的保護范圍內。本專利技術具體實施例中使用的海水取自山東省煙臺市沿海，而適合海帶生長的海水都適用于本專利技術。實施例1抗除草劑海帶孢子體細胞的制備方法，具體步驟如下：(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在1×106個/mL(用血球計數板計數)，轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈；(2)轉化載體的來源和質粒D本文檔來自技高網...

【技術保護點】
抗除草劑海帶孢子體的制備方法，具體步驟如下：(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5?7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在5×10

【技術特征摘要】
1.抗除草劑海帶孢子體的制備方法，具體步驟如下：(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在5×105-2×106個/mL，轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈；(2)轉化載體的來源和質粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取試劑盒提取質粒pBA002-Bar的DNA，用以基因槍轟擊后的共培養和目標基因的轉化；(3)基因槍操作技術過程：擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；(4)共培養與基因轉化：向轟擊后的品系13號的雌配子體細胞加入步驟(2)中提取的質粒pBA002-Bar的DNA，在11-13℃條件下共培養48小時；然后加入質量濃度為40mg/L的草丁膦，連續培養三周，篩選出轉化的雌配子體細胞；(5)抗除草劑海帶孢子體的獲得：將抗除草劑的雌配子體與同型非轉化體雄配子體細胞進行共培養獲得交雜孢子體細胞，經過連續11-13℃低溫條件培養，獲得抗除草劑的孢子體；抗除草劑海帶孢子體共培養和低溫培養的營養液的組成：滅菌海水中添加NaNO3和KH2PO4，滅菌海水中NaNO3的終濃度為8-12mg/L，滅菌海水中KH2PO4的終濃度為0.8-1.1mg/L。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度在1×106個/mL。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔從光，姜國勇，王愛華，鄒積華，徐坤，
申請(專利權)人：中國農業大學煙臺研究院，青島農業大學，
類型：發明
國別省市：山東,37