一種以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選用于治療脂肪性肝炎藥物的方法技術

本發明專利技術公開了凋亡信號調節激酶1（ASK1）的用途，以凋亡信號調節激酶1?N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物。本發明專利技術還公開了以凋亡信號調節激酶1?N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物的方法。本發明專利技術首次公開了ASK1的N端二聚化對于ASK1的磷酸化激活以及ASK1?JNK信號通路具有重要意義，對于肝臟細胞脂肪變性具有重要的調控作用，可促進肝臟脂肪變性的發展。以ASK1的N端二聚化為靶點，通過檢測候選物質是否抑制ASK1的N端二聚化，可以篩選新型預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物。

【技術實現步驟摘要】
一種以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選用于治療脂肪性肝炎藥物的方法
本專利技術屬于生物
，具體地說，本專利技術涉及一種以凋亡信號調節激酶1(ASK1,Apoptosissignal-regulatedkinase1)N端二聚化為靶點的篩選模型的建立，并將篩選得到的ASK1N端二聚化抑制劑應用于制備預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎疾病的藥物中。
技術介紹
凋亡信號調節激酶1(ASK1,Apoptosissignal-regulatedkinase1)是有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一。ASK1蛋白包含1375個氨基酸殘基，分子量約為160kDa[1]。ASK1的蛋白結構分為5部分，其中N端的46-277號氨基酸為硫氧還蛋白(Trx)結合區，297-324號氨基酸為N端卷曲螺旋結構域，384-655號氨基酸為TRAF結合區，687-945號氨基酸為ASK1的激酶結構域，而1239-1295號氨基酸則為C端卷曲螺旋結構域[2]。在正常狀態下，ASK1通過C端的卷曲螺旋結構域進行同源寡聚反應，形成分子量約為1500-2000kDa的高分子量復合體，同時Trx結合在ASK1的N端的Trx結合區，形成ASK1信號小體。Trx的特異性結合可抑制TRAF2、TRAF6與ASK1結合，從而抑制ASK1的活性。當受到如TNF-α、LPS、內質網壓力、氧化壓力等刺激時，Trx迅速被激活并與ASK1分離，TRAF2、TRAF6被募集并結合到ASK1的TRAF結合區上，ASK1的激酶結構域被磷酸化，使ASK1激活，誘導SEKI2-JNK及MKK3/MKK6-p38信號級聯反應[3]。ASK1對于多種疾病均具有重要的調控作用，其可促進AngⅡ誘導的心肌肥厚、心臟重構、間質纖維化以及冠狀動脈重構等[4]；可促進腦缺血再灌注后神經元-小神經膠質細胞的死亡，從而惡化腦卒中疾病的發展[5]；在缺血再灌注誘導的急性腎損傷模型中，ASK1被顯著激活[6]。基于ASK1的激活機制以及其對多種疾病的調控作用，目前已有多種研究致力于研發可調控ASK1信號級聯反應的藥物，以達到治療疾病的目的。肝臟是機體的一個主要的調控糖代謝以及脂肪代謝的組織器官，而以肝細胞脂質聚集以及肝臟脂肪變性為病理表現的脂肪性肝炎，由于其在世界范圍內的高發病率，已經成為人類的一個主要的健康問題。其可進一步損害消化系統功能、降低人體免疫力、減弱解毒功能、影響激素代謝等，嚴重影響了人們的身體健康和生活質量，也給社會帶來沉重負擔。因此，如何有效治療脂肪性肝炎，如何高效的篩選能有效治療脂肪性肝炎這一疾病的藥物成為現階段亟待解決的問題。有研究表明，在高脂飲食誘導的Ⅱ型糖尿病以及肝臟脂肪變性模型中，ASK1起到了明顯的促進作用[7]。但ASK1的作用機制還有必要進行進一步的研究，從而找到肝臟脂肪變性調節的良好靶點。參考文獻[1]IchijoH,NishidaE,IrieK,etal.InductionofapoptosisbyASK1,amammalianMAPKKKthatactivatesSAPK/JNKandp38signalingpathways[J].Science,1997,275(5296):90-94.[2]FujinoG,NoguchiT,MatsuzawaA,etal.ThioredoxinandTRAFfamilyproteinsregulatereactiveoxygenspecies-dependentactivationofASK1throughreciprocalmodulationoftheN-terminalhomophilicinteractionofASK1[J].Molecularandcellularbiology,2007,27(23):8152-8163.[3]T.Noguchi,K.Takeda,A.Matsuzawa,K.Saegusa,H.Nakano,J.Gohda,J.Inoue,H.Ichijo,Recruitmentoftumornecrosisfactorreceptorassociatedfactorfamilyproteinstoapoptosissignal-regulatingkinase1signalosomeisessentialforoxidativestress-inducedcelldeath,J.Biol.Chem.280(2005)37033–37040.[4]IzumiyaY,KimS,IzumiY,etal.Apoptosissignal-regulatingkinase1playsapivotalroleinangiotensinII–inducedcardiachypertrophyandremodeling[J].CirculationResearch,2003,93(9):874-883.[5]ShiY,PuH,HuX,etal.AberrantActivationofASK1MediatesProinflammatoryandNeurotoxicMicroglialResponsesAfterCerebralIschemia/Reperfusion[J].Stroke,2016,47(Suppl1):A147-A147.[6]TeradaY,InoshitaS,KuwanaH,etal.Importantroleofapoptosissignal-regulatingkinase1inischemicacutekidneyinjury[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2007,364(4):1043-1049.[7]YamamotoE,DongYF,KataokaK,etal.Olmesartanpreventscardiovascularinjuryandhepaticsteatosisinobesityanddiabetes,accompaniedbyapoptosissignalregulatingkinase-1inhibition[J].Hypertension,2008,52(3):573-580.
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種凋亡信號調節激酶1的用途，以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物，所述的藥物能夠抑制凋亡信號調節激酶1N端二聚化。在本專利技術的第二方面，提供一種以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物的方法，包括如下步驟：(a)將含有凋亡信號調節激酶1N端的體系和候選物質進行接觸；所述的含有凋亡信號調節激酶1N端的體系是含有凋亡信號調節激酶1N端的細胞，或是含含有凋亡信號調節激酶1N端的溶液；(b)觀察候選物質對于凋亡信號調節激酶1N端二聚化的影響；其中，若所述候選物質可抑制凋亡信號調節激酶1N端二聚化，則表明該候選物質是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質。在另一優選例中，包括如下步驟：步驟(a)包括：在測試組中，將候選物質加入到含有凋亡信號調節激酶1N端的體本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種凋亡信號調節激酶1的用途，其特征在于，以凋亡信號調節激酶1?N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物。

【技術特征摘要】
1.一種凋亡信號調節激酶1的用途，其特征在于，以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物。2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物能夠抑制凋亡信號調節激酶1N端二聚化。3.一種以凋亡信號調節激酶1N端二聚化為靶點篩選預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的藥物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：（a）將含有凋亡信號調節激酶1N端的體系和候選物質進行接觸；所述的含有凋亡信號調節激酶1N端的體系是含有凋亡信號調節激酶1N端的細胞，或是含含有凋亡信號調節激酶1N端的溶液；（b）觀察候選物質對于凋亡信號調節激酶1N端二聚化的影響；其中，若所述候選物質可抑制凋亡信號調節激酶1N端二聚化，則表明該候選物質是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（a）包括：在測試組中，將候選物質加入到含有凋亡信號調節激酶1N端的體系中；和/或步驟（b）包括：檢測測試組的體系中凋亡信號調節激酶1N端的二聚化作用，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的含有凋亡信號調節激酶1N端的體系；其中，如果測試組中檢測結果顯示凋亡信號調節激酶1N端二聚化受抑制，就表明該候選物質是預防、緩解和/或治療脂肪性肝炎的潛在物質。5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（a）包括：（1）選用CheckMate?哺乳動物雙雜交系統，分別將編碼凋亡信號調節激酶1N端1-678號氨基酸的DNA連接至編碼DNA結合結構域的pBIND載體以及轉錄激活結構域的pACT載體中，并將兩種載體轉染至動物細胞中，構建凋亡信號調節激酶1N端二聚化哺乳動物雙雜交篩選系統；若凋亡信號調節激酶1的N端正常二聚化，則當上述細胞繼續轉染入pG5luc載體后，螢火蟲熒光素酶報告基因高水平表達；若凋亡信號調節激酶1的N端二聚化被抑制，則pG5luc載體上的螢火蟲熒光素酶報告基因不表達；通過Dual-Luciferase雙熒光素酶報告基因檢測系統可分析凋亡信號調節激酶1的N端二聚化情況；其中，編碼凋亡信號調節激酶1N端1-678號氨基酸的氨基酸序列如SEQNO：1所示，核苷酸序列如SEQNO：2所示；（2）將候選短肽的核苷酸片段分別連接至psi-Flag載體中，將候選短肽質粒psi-flag-Peptides與pG5luc質粒同時轉染上述已構建的用于凋亡信號調節激酶1N端二聚化篩選的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李紅良，王丕曉，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：湖北,42