IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構建與應用制造技術

本發明專利技術公開了一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構建與應用；通過同源重組，用2.245?kb?frt?neo?frt?loxp?Flox?loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS

【技術實現步驟摘要】
IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構建與應用
本專利技術涉及生物
中的動物模型，更具體地說，是涉及一種IRTKS基因肝臟特性剔除的小鼠模型，其構建方法，及其應用。
技術介紹
糖尿病是由遺傳因素，環境因素和生活行為等多種因素共同作用引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病的患病率，致殘率和病死率以及對總體健康的危害程度，已居于慢性非傳染性疾病的第三位，糖尿病及其并發癥所造成的死亡率人數也已居于世界死亡原因的第五位。有研究報道2013年世界糖尿病患病人數已達到3.82億，并預計到2030年增加到5.52億人。過去30多年來，隨著我國經濟快速發展，國內糖尿病的患病率增加了十幾倍，1980年全國14省市30萬人調查資料顯示糖尿病的患病率為0.67％；2010年調查顯示，我國18歲以上的人群糖尿病患病率為9.7％。根據國際糖尿病聯合會的數據，我國2014年的糖尿病患病人數為9629萬人，位居全球首位。因此糖尿病的高發病率引起全球的高度重視。為了深入探索糖尿病的發病機制，良好的動物模型是非常必要的研究工具。早期，研究人員通過物理，化學，生物等致病因素，人工誘發具有糖尿病特征的實驗動物模型，自發性遺傳性糖尿病模型由于沒有人為的干預因素，更能模擬人類真實的糖尿病發病機制，其應用于糖尿病發病機制及并發癥方便的科研價值較大，較常見的有ob/ob，db/db小鼠等，分別是由于瘦素基因或瘦素基因受體的突變導致的肥胖伴隨嚴重的胰島素抵抗，但這些動物模型的局限性在于它所基于的基因突變遺傳背景在人類患者中并不常見。近年來，隨著研究人員對糖尿病發病機制了解的深入，以及轉基因動物模型技術的日趨成熟，基于疾病的相關關鍵信號通路的轉基因或基因剔除動物模型在糖尿病的研究中應用增多。另一方面，由于糖尿病是一組多種遺傳背景和環境因素相互作用而引發的臨床綜合癥，目前雖然開發的糖尿病動物模型很多，但與人類糖尿病仍有偏差，至今尚無與人類糖尿病完全吻合的動物模型。基于糖尿病發病機制的研究新進展，開發獲得較好模擬人類糖尿病的動物模型仍然是我們探索糖尿病，胰島素抵抗的有效工具和必需研究途徑。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構建與應用。它可以為糖尿病的研究及分子發病機制的探討提供研究模型。本專利技術的目的是通過以下技術方案來實現的：第一方面，本專利技術涉及一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型的構建方法，通過同源重組的方法，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合體小鼠；將獲得的嵌合體小鼠與肝臟特異性表達Cre的小鼠Alb-Cre交配，最終獲得IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。優選的，所述構建方法包括如下具體步驟：S1、構建IRTKS-CKO質粒；S2、ES細胞基因打靶及篩選陽性克隆；S3、陽性ES克隆注射小鼠囊胚，獲得IRTKSflox/+的嵌合體小鼠；S4、將嵌合體雄鼠與雌鼠繁育，獲得雙臂陽性F1代小鼠；S5、將F1代小鼠或其后代與Alb-Cre小鼠交配。優選的，步驟S1中，IRTKS-CKO質粒DNA用NotI酶切，分離純化，無水乙醇沉淀，無菌PBS重懸，獲得IRTKS-CKO質粒。優選的，步驟S2中，ES細胞為SCR012，克隆篩選條件為300μg/mlG418和2μMGanC篩選8天。優選的，步驟S2還包括用PCR方法鑒定陽性ES克隆；5’PCR鑒定的引物對序列如SEQIDNO：1、2所示；3’PCR鑒定的引物對序列如SEQIDNO：3、4所示。優選的，步驟S3中，所述嵌合體小鼠為嵌合率在50％以上的雄性小鼠。優選的，步驟S3中提供囊胚的小鼠和步驟S4中的雌鼠均為C57BL系小鼠。優選的，步驟S5還包括用PCR方法鑒定基因型；野生型WTPCR的鑒定引物對為SEQIDNO：7、8，突變型NeoPCR的鑒定引物對為SEQIDNO：5、6。第二方面，本專利技術還涉及一種上述構建方法獲得的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。第三方面，本專利技術還涉及一種上述構建方法獲得的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型在制備或篩選糖尿病治療藥物中的應用。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：1)本專利技術通過同源重組，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合體小鼠。利用Cre重組酶的特性，將獲得的嵌合體小鼠與肝臟特異性表達Cre的小鼠Alb-Cre交配，構建了可靠的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。2)通過對IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型體重，空腹血糖，糖耐量，及病理檢測分析，發現IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠出現體重增加，高血糖，葡萄糖耐量降低，并且肝臟切片中伴有空泡樣脂肪變，這與人類的發病特征相符，從而為糖尿病發病機制的研究以及治療藥物的評價和篩選提供了良好的動物模型。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本專利技術的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：圖1是本專利技術實施例1IRTKS-CKO小鼠的打靶質粒構建示意圖；其中，A為打靶載體的構建策略，B為打靶載體的示意圖，C為IRTKS-CKO打靶示意圖；圖2是本專利技術實施例1IRTKS-CKO小鼠的基因型鑒定結果示意圖；其中，a為首代嵌合體小鼠基因型的5’arm的鑒定結果，b為首代嵌合體小鼠基因型的3’arm的鑒定結果；圖3是本專利技術實施例2IRTKS-LKO小鼠的基因型鑒定策略，其中P5/P6引物擴增的neo為插入loxp位點單個等位基因，P7/P8引物擴增的WT為未插入loxp位點的單個等位基因；圖4是本專利技術實施例2IRTKS基因肝臟特異性剔除小鼠的基因型PCR鑒定結果示意圖；圖5是本專利技術實施例2熒光定量PCR鑒定不同組織中IRTKSmRNA的表達水平；圖6是本專利技術實施例2IRTKS基因肝臟特異性剔除小鼠的基因型Western-blot驗證結果示意圖；圖7是本專利技術實施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠體重對比示意圖；圖8是本專利技術實施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠空腹血糖值對比示意圖；圖9是本專利技術實施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠胰島素耐量曲線圖；圖10是本專利技術實施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠肝臟組織HE染色圖；其中，a為WT小鼠在正常飲食下肝臟的HE染色結果，b為LKO小鼠在正常飲食下肝臟的HE染色結果。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利技術構思的前提下，還可以做出若干調整和改進。這些都屬于本專利技術的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆，實驗室手冊(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、IRTKS-CK本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型的構建方法，其特征在于，通過同源重組的方法，用2.245?kb?frt?neo?frt?loxp?Flox?loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS

【技術特征摘要】
1.一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型的構建方法，其特征在于，通過同源重組的方法，用2.245-kbfrt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKSflox/+的嵌合體小鼠；將獲得的嵌合體小鼠與肝臟特異性表達Cre的小鼠Alb-Cre交配，最終獲得IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下具體步驟：S1、構建IRTKS-CKO質粒；S2、ES細胞基因打靶及篩選陽性克隆；S3、陽性ES克隆注射小鼠囊胚，獲得IRTKSflox/+的嵌合體小鼠；S4、將嵌合體雄鼠與雌鼠繁育，獲得雙臂陽性F1代小鼠；S5、將F1代小鼠或其后代與Alb-Cre小鼠交配。3.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟S1中，IRTKS-CKO質粒DNA用NotI酶切，分離純化，無水乙醇沉淀，無菌PBS重懸，獲得IRTKS-CKO質粒。4.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟S2中，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓澤廣，黃麗鈺，吳崇超，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：上海,31