一種山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法，采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設計TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列，構建同時表達sgRNA和Cas9?D10A的質粒PYSY?sgRNA，連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，最后對轉化子進行驗證；酶切和測序鑒定證明TLR4基因敲除載體構建正確。本發(fā)明專利技術采用CRISPR/Cas9構建的載體，為后續(xù)獲得山羊TLR4基因缺失型肺泡上皮細胞系，研究支原體肺炎感染的免疫應答分子機制提供理論依據(jù)。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法
本專利技術屬于基因工程
，尤其涉及一種山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法。
技術介紹
Toll樣受體(TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中的一種重要模式識別受體，可選擇性識別病原微生物而啟動天然免疫,在宿主天然免疫和獲得性免疫中具有重要作用。TLR4是TLRs家族的重要成員之一，是內毒素脂多糖(LPS)最重要的模式識別受體，在介導陰性菌及其LPS的宿主反應中發(fā)揮關鍵作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌在噬菌體長期的選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機制之一。在菌體內，CRISPR簇在其前導區(qū)的調控下轉錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，引導crRNA/tracrRNA/Cas9復合體識別結合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被開發(fā)成了一種新型的基因打靶系統(tǒng)。相對于較早的RNAi、ZFN和TALEN系統(tǒng)，這種新型打靶系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、效率高、可同時沉默任意數(shù)量基因等優(yōu)點。目前，該項技術已經(jīng)應用于細菌、斑馬魚、小鼠、大鼠、家蠶以及哺乳動物和人類細胞系等，且都表現(xiàn)出較強的基因組編輯活性。Hu等(2014)應用該技術對山羊成纖維細胞中NUP155基因進行了敲除，發(fā)現(xiàn)23個單細胞克隆中有5個發(fā)生了NUP155基因突變。Wang等(2015)采用CRISPR/Cas9技術對山羊MSTN和FGF5基因進行了敲除。以上研究提示該技術可以成功用于山羊基因敲除。目前采用ZFNs或TALENs進行基因敲除，對每個基因位點編輯都需要設計和組裝兩個核酸酶,構建技術難度較大、構建組裝時間較長。另外，傳統(tǒng)基因敲除，主要是應用基因重組原理通過插入突變和靶向技術使目的基因功能喪失。然而，目前在山羊上關于TLR4基因敲除及相關功能研究尚未見報道。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于提供一種山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法，旨在解決目前采用ZFNs或TALENs進行基因敲除，對每個基因位點編輯都需要設計和組裝兩個核酸酶,因而構建技術難度較大、構建組裝時間較長；而且傳統(tǒng)基因敲除，主要是應用基因重組原理通過插入突變和靶向技術使目的基因功能喪失的問題。本專利技術是這樣實現(xiàn)的，一種山羊TLR4基因敲除載體，該山羊TLR4基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：TLR4-gRNA-Lg1：GACTCATATTCAGCACCTGAAGG；TLR4-gRNA-Rg1：TCACAACAAACTCTTGTCATTGG。一種引物Oligo，該引物Oligo序列為：F-TLR4-gRNA-L1：CACCGACTCATATTCAGCACCTGA；R-TLR4-gRNA-L1：AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC；F-TLR4-gRNA-R1：CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT；R-TLR4-gRNA-R1：AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC。一種表達sgRNA核苷酸的質粒PYSY-sgRNA，該質粒PYSY-sgRNA為：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo質粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP質粒。本專利技術另一目的在于提供一種山羊TLR4基因敲除載體的構建方法，該山羊TLR4基因敲除載體的構建方法包括：采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設計TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；構建同時表達sgRNA和Cas9D10A的質粒PYSY-sgRNA，連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；最后對轉化子進行驗證。進一步，該山羊TLR4基因敲除載體的構建方法具體包括：引物退火：將1ul100uM的F-Oligo、1ul的100uMR-Oligo、8ulYSYoligo退火緩沖液混合于PCR管內，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃；連接：0.5ul退火產(chǎn)物，1ulYSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質粒，1ulT4連接酶，2ul5*T4Buffer，5.5ulMilliQ；轉化：室溫15min后用pfu≥108的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞進行轉化；轉化子驗證：轉化涂板后挑取單克隆進行10ul體系菌液PCR驗證；經(jīng)PCR初步鑒定后進行測序；菌液37℃過夜培養(yǎng)，無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，并采用微量紫外分光光度計測定質粒濃度。進一步，所述轉化涂板后挑取單克隆進行10ul體系菌液PCR驗證，具體包括：挑取單克隆0.5ul菌液，0.5ulYSY驗證正向引物，0.5ulR-Oligo，5ulMastermix，3.5ulMilliQ；PCR反應條件為：1)：95℃預變性2mim；2)：94℃變性30s；3)：56℃退火30s；4)：72℃延伸30s；步驟2)到步驟4)運行35個循環(huán)；5)：72℃再延伸10min；6)：4℃保存。本專利技術提供的山羊TLR4基因敲除載體及其構建方法中CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是新開發(fā)的一種新型的基因打靶系統(tǒng)，利用細菌或古生菌中存在的的CRISPR簇，在其前導區(qū)的調控下轉錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，cRNA和tracrRNA二者結合形成的復合物成為，sgRNA與Cas9核酸內切酶結合,并引導其識別結合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達。本專利技術采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建TLR4基因敲除載體，方法簡單快捷，只需針對該基因敲除位點設計一個長約20bp左右的sgRNA，然后連接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs進行基因敲除，對每個基因位點編輯都需要設計和組裝兩個核酸酶,構建技術難度較大、構建組裝時間較長。因此，與傳統(tǒng)的ZFNs、TALENs等基因敲除技術比較而言，采用CRISPR/Cas9構建基因敲除載體更為簡單快捷，便于進一步推廣和應用于后續(xù)實驗。另外，傳統(tǒng)基因敲除，主要是應用基因重組原理通過插入突變和靶向技術使目的基因功能喪失，與ZFN和TALEN這兩種人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9作為切口酶，具有單鏈切割活性，可以在特定位置制造單鏈切口，這樣基本不會引起非同源末端連接，從而高效地介導外源基因的定點敲入，或對基因組進行點突變，大大降低了非同源末端連接所帶來的風險。本專利技術構建的載體，利用RNA導向的CRISPR-Cas9系統(tǒng)形成雙切口，在未影響靶向切割效率的前提下大大降低了脫靶效應，提高基因敲除效率。本專利技術采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建TLR4敲除載體，為后續(xù)獲得山羊TLR4基因缺失型肺泡上皮細胞系、研究山羊肺炎支原體感染的免疫應答分子機制提供理論依據(jù)。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的山羊TLR4基因敲除載體的構建方法流程圖；圖2是本專利技術實施例提供的PCR驗證克隆電泳圖片示例一；圖中：Marker：Trans2KPlusDNAMarker，從下到上依次為100bp,250bp,500bo,750bp,1000bp,3000bp,5000bp；2:陰性對照；3-6:TLR4-gRNA-Rg1克隆本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種山羊TLR4基因敲除載體，其特征在于，該山羊TLR4基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：SEQ?ID?NO1和SEQ?ID?NO2。

【技術特征摘要】
1.一種山羊TLR4基因敲除載體，其特征在于，該山羊TLR4基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：SEQIDNO1和SEQIDNO2。2.一種包含權利要求1所述的sgRNA核苷酸合成對應的引物Oligo，其特征在于，該引物Oligo序列為：SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6。3.一種表達權利要求1所述的sgRNA核苷酸的質粒PYSY-sgRNA，其特征在于，該質粒PYSY-sgRNA為：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo質粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP質粒。4.一種如權利要求1所述的山羊TLR4基因敲除載體的構建方法，其特征在于，該山羊TLR4基因敲除載體的構建方法包括：采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設計TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；構建同時表達sgRNA和Cas9D10A的質粒PYSY-sgRNA，連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞；最后對轉化子進行驗證。5.如權利要求4所述的山羊TLR4基因敲除載體的構建方法，其特征在于，該山羊TLR4基因敲除載體的構建方法具體包括：...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：惠文巧，陳勝，湯繼順，班謙，
申請(專利權)人：安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：安徽,34