一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，步驟包括：(1)樣品預處理；(2)酶解；(3)超濾；(4)陰離子交換層析；(5)SephadexG25凝膠層析；(6)高效液相色譜分離純化；最終獲得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽。本發明專利技術安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽純度高，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。

【技術實現步驟摘要】
一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法
本專利技術涉及一種海洋活性多肽，特別涉及一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法。
技術介紹
肺癌是全球范圍內發病率最高的惡性腫瘤，近年來發病率、死亡率逐年上升，已成為腫瘤相關死亡的首要病因。肺癌約80％是非小細胞肺癌，在晚期肺癌中的比例達到總數的40％～50％。目前對于非小細胞肺癌的治療早期是手術切除，晚期主要是化療，但化療的毒副作用及產生的耐藥性，影響治療的有效性，因此尋找精準治療是熱門話題。海洋是一個巨大的藥物寶庫，從海洋中尋找活性物質已成為熱點，并從中分離獲得多種活性物質，如肽類、多糖、生物堿、萜類、大環內脂等，有望開發成新型的抗腫瘤藥物，如從海兔獲得的dolastatin10已進入臨床試驗。沙蠶(Nereis)屬于環節動物門(Annelida)多毛綱(Polychaeta)沙蠶科(Nereididae)，又稱為海蟲、海蜈蚣、海螞蟥等，其生物資源豐富，廣泛分布在我國沿海地區，近年來人工養殖用于鉤魚的誘餌。沙蠶是一種傳統的海洋中藥，有清熱解毒，消腫止痛，斂瘡生肌，主治癰瘡腫毒等功效。學者們從沙蠶體內獲得了具有良好藥理活性的物質。吉林大學從日本刺沙蠶體內分離出一種沙蠶絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶抑制血小板聚集，改變血液流變學特性，可作為降纖和溶栓藥物，預防和治療心、腦梗塞，腦動脈、肺動脈血栓形成等疾病。然沙蠶酶解多肽的研究較少，而對非小細胞肺癌A549細胞的抑制活性目前尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽純度高，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是：一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，步驟如下：(1)樣品預處理：將雙齒圍沙蠶解凍后，清洗干凈，勻漿，得到勻漿液；(2)酶解：按照每克勻漿液加1mL純凈水的配比，將勻漿液與純凈水混勻，調節pH至11，加入堿性蛋白酶，酶解后得酶解液；(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經超濾獲得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分；(4)陰離子交換層析：收集步驟(3)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分，冷凍干燥，經DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析，梯度洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物；(5)SephadexG25凝膠層析：將步驟(4)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物采用SephadexG-25凝膠層析分離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的SephadexG25凝膠層析產物；(6)高效液相色譜分離純化：對步驟(5)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的SephadexG25凝膠層析產物經濾膜過濾后用采用反相高效液相色譜法分離純化，收集主峰，冷凍干燥后獲得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽。本專利技術首次通過酶解的方法從沙蠶體內提取獲得具有抗肺癌作用的多肽，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。作為優選，步驟(2)按照每克勻漿液加300U的加酶量加入堿性蛋白酶，50℃酶解6小時得酶解液。作為優選，步驟(4)DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析的分離條件為：pH7.2、0.2mM的Tris-HCl緩沖溶液平衡柱子后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為2mL，每次上樣前過0.22μm的膜。作為優選，步驟(5)蒸餾水洗脫的洗脫流速為1.1mL/min。作為優選，步驟(6)反相高效液相色譜法分離純化的色譜條件：色譜柱：ZORBAXSB-C18分析型色譜柱；檢測波長：280nm；流速：0.5mL/min；流動相A為含0.05％三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.05％三氟乙酸的超純水，采用梯度洗脫方式：20％～100％A洗脫5～20min；平衡時：流動相A與流動相B的流動相體積比為20：80；柱溫：25℃；自動進樣，進樣量：10μL。本專利技術的有益效果是：安全性好，反應條件溫和，過程控制容易，所得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽純度高，對肺癌細胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫學應用價值。附圖說明圖1五種蛋白酶酶解物對A549細胞的抑制率。圖2不同分子量的沙蠶多肽對A549細胞增殖的影響。圖3陰離子DEAESepharoseFastFlow洗脫峰。圖4葡聚糖凝膠柱洗脫峰。圖5反相高效液相色譜柱洗脫峰。圖6PAP對A549細胞活性的影響。圖7PAP對H1299細胞活性的影響。圖8倒置顯微鏡下的A549細胞(×200)。圖9倒置顯微鏡下的H1299細胞(×200)。圖10A549細胞形態,AO/EB染色(×200)。圖11H1299細胞形態,AO/EB染色(×200)。圖12PAP對A549細胞形態變化的影響，24hHoechst33258染色(×200)。圖13PAP對H1299細胞形態變化的影響，24hHoechst33258染色(×200)。圖14A549細胞AnnexinV-FITC/PI雙染24h。圖15H1299細胞AnnexinV-FITC/PI雙染24h。圖16A549細胞線粒體膜電位的變化24h。圖17H1299細胞線粒體膜電位的變化24h。具體實施方式下面通過具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的具體說明。本專利技術中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。實施例：1材料與方法1.1原料1.1.1樣品與試劑沙蠶購于舟山市水產養殖場，經浙江海洋大學趙盛龍教授鑒定為雙齒圍沙蠶(Perinereiesaibuhitensis)，鮮活購買后待用。Folin試劑，上海如吉生物科技發展有限公司；酪氨酸，上海如吉生物科技發展有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，北京亞太恒信生物科技有限公司；酪蛋白，北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；1640粉末培養基，Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，美國sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，美國sigma公司；美國sigma公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，南京凱基生物發展有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒，北京貝博生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。1.1.2細胞人肺癌A549和H1299細胞株均購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代培養。1.2主要儀器與設備DS-1組織搗碎機，上海標準模型廠；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；GF16RXII日立高速低溫離心機，日本HITACHI公司；ALPHA1-4/LDplus型冷凍干燥機，德國CHRIST公司；BSA124S型電子天平，德國SatoriusAG公司本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，其特征在于，步驟如下：(1)樣品預處理：將雙齒圍沙蠶解凍后，清洗干凈，勻漿，得到勻漿液；(2)酶解：按照每克勻漿液加1mL純凈水的配比，將勻漿液與純凈水混勻，調節pH至11，加入堿性蛋白酶，酶解后得酶解液；(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經超濾獲得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分；(4)陰離子交換層析：收集步驟(3)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分，冷凍干燥，經DEAE?Sepharose?Fast?Flow陰離子交換層析，梯度洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物；(5)Sephadex?G25凝膠層析：將步驟(4)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物采用Sephadex?G?25凝膠層析分離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的Sephadex?G25凝膠層析產物；(6)高效液相色譜分離純化：對步驟(5)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的Sephadex?G25凝膠層析產物經濾膜過濾后用采用反相高效液相色譜法分離純化，收集主峰，冷凍干燥后獲得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽。...

【技術特征摘要】
1.一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，其特征在于，步驟如下：(1)樣品預處理：將雙齒圍沙蠶解凍后，清洗干凈，勻漿，得到勻漿液；(2)酶解：按照每克勻漿液加1mL純凈水的配比，將勻漿液與純凈水混勻，調節pH至11，加入堿性蛋白酶，酶解后得酶解液；(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經超濾獲得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分；(4)陰離子交換層析：收集步驟(3)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的活性組分，冷凍干燥，經DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析，梯度洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物；(5)SephadexG25凝膠層析：將步驟(4)獲得的對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產物采用SephadexG-25凝膠層析分離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細胞A549增殖抑制率最高的SephadexG25凝膠層析產物；(6)高效液相色...

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁國芳，賈盈露，楊最素，鄭媛媛，吳宗澤，黃芳芳，唐云平，
申請(專利權)人：浙江海洋大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33