一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽及其制備方法，包括脫鈣處理、復合酶魚骨脫脂酶解及純化干燥步驟，該制備方法制備得到的金槍魚骨膠原多肽的分子量為500~2000?Da，接觸角為10.0~25.0°其在5~200?μg/mL濃度下可以促進MC3T3?E1細胞生長。本發明專利技術制備工藝科學合理，充分利用水產品加工中未利用的魚骨為原料，開發具有潛在市場價值的膠原多肽，并采用復合酶脫脂酶解的方法，調節復合酶酶解條件，得到一種可促進骨細胞生長的且安全無毒副作用等優點的金槍魚骨膠原多肽，提高生產效率，降低能耗，工藝科學合理、易于操作。

【技術實現步驟摘要】
一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽及其制備方法
本專利技術屬于生物醫藥領域，涉及一種魚類骨膠原多肽及其制備方法，尤其涉及一種促進骨細胞生長的金槍魚魚骨膠原多肽及其制備方法。
技術介紹
骨質酥松是人類常見病，由于其嚴重的危害著人類的健康，所以人們越來越關注骨質酥松的治療。骨是由有機/無機復合材料即膠原蛋白和羥基磷灰石組成，因此膠原蛋白的流失必然會影響骨中鈣的含量。因此提高骨中膠原蛋白的含量是治療骨質酥松的一個可靠方法。膠原多肽是膠原蛋白在一定條件下水解而得到的水解物。與膠原蛋白相比，膠原多肽的分子量低、水溶解性較好，易被人體吸收。與此同時，膠原蛋白的水解物也具有了更多的生物活性，如：抗氧化性，延緩衰老，補鈣促進骨骼發育提高免疫力，促進骨細胞再生等。目前的膠原水解物主要來源于豬、牛等動物。但是，這些膠原水解物可能存在免疫原性、宗教信仰等問題。隨著國內水產加工業的發展，水產加工企業產生的下腳料如魚頭、魚皮、魚鱗、魚骨、魚鰭等逐年增長。但是，水產加工下腳料的利用并不充分，造成資源浪費。來源于魚類的膠原水解物無疾病危害且沒有宗教限制。膠原多肽制備的傳統工藝可分為三類，即酸法、堿法以及酶法。其基本原理都是根據膠原蛋白的特性，改變蛋白質的外界環境，把膠原蛋白從其他蛋白質中分離出來。酸法和堿法是將膠原蛋白在酸性和堿性環境下提取出來，酸法比較廣泛，而堿法報道較少。生物酶法是利用酶反應的溫和高效益在一定的環境條件下將膠原蛋白從不同的原料中提取出來。隨著酶制劑工業的不斷發展與應用領域的不斷拓寬，酶制劑產量迅速增長，市場競爭優勢不斷增加。在復合酶的選擇中，主要選擇用膠原酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶。膠原酶酶切位點為脯氨酸與甘氨酸的之間肽鍵，木瓜蛋白酶應用范圍廣主要由于其作用位點、切割位點多，如賴氨酸、精氨酸甘氨酸的羧基端；堿性蛋白酶的作用位點則主要以羧基側為疏水性芳香族氨基酸的肽鍵；中性蛋白酶的作用位點為羧基側的亮氨酸、苯丙氨酸的肽鍵。有研究者認為末端含有甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸的氨基酸序列可以顯著促進成骨細胞的增長粘附。金槍魚是魚中的名貴品種，是溫水魚。其通過調節自身溫度適應環境溫度，其膠原蛋白含量較多（36%-54%），是膠原多肽提取的合適原料。本專利技術從魚骨中提取膠原多肽，其魚骨氨基酸中甘氨酸較多，有利于成骨細胞生長。
技術實現思路
為了克服現有技術存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽及其制備方法，本專利技術制備工藝科學合理，充分利用水產品加工中未利用的魚骨為原料，開發具有潛在市場價值的膠原多肽，并采用復合酶脫脂酶解的方法，調節復合酶酶解條件，得到一種可促進骨細胞生長的且安全無毒副作用等優點的金槍魚骨膠原多肽，提高生產效率，降低能耗，工藝科學合理、易于操作。本專利技術采用如下技術方案：一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，包括如下步驟：（1）脫鈣處理：將金槍魚的魚骨清洗干凈并置于酸性溶液中浸泡；（2）復合酶魚骨脫脂酶解：將處理后的魚骨用脂肪酶和蛋白酶復合酶解，酶解溫度為30~60℃，酶解5~12小時；酶解液加熱到90~95℃滅酶10~15min，熱水提取，得到金槍魚骨膠原多肽溶液；（3）純化干燥步驟：過濾，經過冷凍干燥得到金槍魚骨膠原多肽粉末成品。進一步的，步驟（1）所述的脫鈣處理中，酸性溶液為0.3~0.4wt%鹽酸溶液或者硫酸溶液，浸泡時間為4~24h，優選為5~9h，每1.5h更換一次酸溶液。進一步的，步驟（1）和步驟（2）之間還包括去除雜蛋白步驟：將脫鈣魚骨置于氯化鈉溶液中浸泡后，用去離子水反復清洗，其中所述氯化鈉溶液的濃度為2~8wt%，優選3~5wt%，浸泡魚骨時間為8~14小時，優選10~12小時。進一步的，所述的復合酶脫脂酶解步驟具體為：將處理后的魚骨與去離子水按重量比例1:5~20混合，優選1:9~20，調節pH為2~10，基于魚骨的質量，加入0.1~0.6wt%的脂肪酶和0.25~3.0wt%的蛋白酶，優選為0.3~0.5wt%加入脂肪酶和0.5~2.0wt%的蛋白酶，酶解溫度為40~55℃，酶解6~10小時。進一步的，所述的蛋白酶為膠原酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種或多種，優選為膠原酶和木瓜蛋白酶。本專利技術還保護上述制備方法制備得到的金槍魚骨膠原多肽，當所述的金槍魚骨膠原多肽的分子量為500~2000Da，接觸角為10.0~25.0°其在5~200μg/mL濃度下可以促進MC3T3-E1細胞生長。本專利技術調節pH的堿性物質并沒有特別限制，置于其水溶液顯示堿性即可。優選為無機堿性。無機堿的例子包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰或氫氧化鈣。本專利技術調節pH的酸性物質并沒有特別限制，置于其水溶液顯示酸性即可。優選為有機酸或無機酸。有機酸例如醋酸、檸檬酸。本專利技術的酸性物質更優選為無機酸。無機酸的例子包括但不限于鹽酸、硫酸、磷酸或硝酸。本專利技術中去除脂肪所用的酶沒有特別限制。脂肪酶例如堿性脂肪酶、中性脂肪酶和酸性脂肪酶。相比現有技術，本專利技術具有如下有益的技術效果：（1）本專利技術選用本專利技術選用脂肪酶、多種蛋白酶和作為復合酶酶解，通過調控復合酶解條件使末端含有甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸的氨基酸序列的膠原多肽很大程度地釋放出來，得到高性能的膠原多肽，且大大縮短膠原多肽的提取時間，提高生產效率，降低能耗。（2）金槍魚魚骨酶解得到的不同分子量的膠原多肽，安全、無毒副作用，促進成骨細胞生長作用顯著。（3）充分利用水產品加工中未利用的魚骨為原料，開發具有潛在市場價值的膠原多肽。附圖說明圖1為24h、48h、72h不同濃度金槍魚骨膠原多肽對MC3T3-E1細胞粘附性生長的影響。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及有益效果更加清楚，本專利技術用以下具體實施例進行說明，但本專利技術絕非限于這些例子。實施例1以金槍魚魚骨為原料制備促進成骨細胞生長為例，依次進行如下工藝步驟操作：（1）脫鈣處理：解凍金槍魚魚骨，用冷水清洗，室溫下，將魚骨用0.4wt%鹽酸溶液中浸泡7.5h，每1.5h更換一次酸液，去除鈣鹽；再以濃度為4wt%的氯化鈉浸泡魚骨12小時，去除雜蛋白（雜蛋白即為非膠原的蛋白）；（2）復合酶魚骨脫脂酶解：將魚骨清洗干凈、瀝干，魚骨與去離子水的重量比例1:10加入去離子水，調節pH為7，按照濃度為0.4wt%加入中性脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶)，按照濃度為0.5wt%加入一種膠原酶，按照濃度為0.5wt%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度調至50℃，酶解4小時；酶解液加熱到90~95℃滅酶15min，得到金槍魚骨膠原多肽溶液；（3）純化干燥步驟：過濾，冷凍干燥后得到成品。將上述指標方法得到的膠原多肽粉末進行檢測，其中分子量范圍為600~1300Da，接觸角為23°，膠原多肽淡黃色，無腥味。實施例1制備得到的金槍魚骨膠原多肽對MC3T3-E1細胞粘附性生長的影響見圖1所示，如圖展示了不同濃度的膠原多肽（5μg/mL,100μg/mL,200μg/mL）在24h,48h,72h時促進MC373-E1細胞粘附增殖情況，從圖中可以看出隨著多肽濃度的增加，細胞增殖效果更加明顯，而control組（0μg/mL）增殖效果并不明顯。可見，實施例1制備得到的金槍魚本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）脫鈣處理：將金槍魚的魚骨清洗干凈并置于酸性溶液中浸泡；（2）復合酶魚骨脫脂酶解：將處理后的魚骨用脂肪酶和蛋白酶復合酶解，酶解溫度為30~60℃，酶解5~12小時；酶解液加熱到90~95℃滅酶10~15min，熱水提取，得到金槍魚骨膠原多肽溶液；（3）純化干燥步驟：過濾，經過冷凍干燥得到金槍魚骨膠原多肽粉末成品。

【技術特征摘要】
1.一種促進骨細胞生長的金槍魚骨膠原多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）脫鈣處理：將金槍魚的魚骨清洗干凈并置于酸性溶液中浸泡；（2）復合酶魚骨脫脂酶解：將處理后的魚骨用脂肪酶和蛋白酶復合酶解，酶解溫度為30~60℃，酶解5~12小時；酶解液加熱到90~95℃滅酶10~15min，熱水提取，得到金槍魚骨膠原多肽溶液；（3）純化干燥步驟：過濾，經過冷凍干燥得到金槍魚骨膠原多肽粉末成品。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）所述的脫鈣處理中，酸性溶液為0.3~0.4wt%鹽酸溶液或者硫酸溶液，浸泡時間為4~24h，優選為5~9h，每1.5h更換一次酸溶液。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）和步驟（2）之間還包括去除雜蛋白步驟：將脫鈣魚骨置于氯化鈉溶液中浸泡后，用去離子水反復清洗，其中所述氯化鈉溶液的濃度為2~8wt%，優選3~5wt%，浸泡魚骨時...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃雅欽，丁丁，李雪娟，孟兆亭，
申請(專利權)人：北京化工大學，榮成藍潤生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11