利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法技術

本發明專利技術涉及一種熒光切換性質熒光團的核苷酸分子進行測序的方法，這種方法降低了背景信號，提高了獲得信號的準確性。更進一步，本發明專利技術將熒光切換測序和混合核苷酸分子測序技術聯合使用，提供了數據冗余和校驗的特性。其特殊的信號獲得方式和獲得效率，使得其在基因測序方向有很大的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法
本專利技術涉及一種高通量測序方法，屬于基因測序領域。背景介紹高通量測序儀是近幾年高速發展的技術。高通量測序，相較于傳統桑格測序，最大的優勢是可以同時讀出海量的序列信息。雖然準確度不如傳統測序方法，但由于海量數據分析，便可得出超出序列本身的信息，如基因表達量、拷貝數變異。當今主流測序儀均使用SBS(sequencingbysynthesis邊合成邊測序)方法，如solexa/illumina、454、iontorrent等。這些測序儀的結構相似，都包括流體系統，光學系統，和芯片系統。測序反應在芯片內發生。測序過程也很相似，都包括：將反應液通入芯片，發生SBS反應，采集信號，沖洗，進行下一輪。這樣的周期性過程。隨著周期的增多，測出連續的單堿基非兼并序列信息(如ACTGACTG)。然而，高通量測序儀無法徹底消除測序錯誤。測序錯誤可能來源于：反應偶然錯誤或累積錯誤，信號采集錯誤，信號矯正帶來的誤差等等。現有測序儀中，這些化學或光學、軟件上帶來的錯誤，或成為噪聲，在單個讀出位點無法被識別。只能通過深度測序，利用同一序列在不同位點的多次讀取進行消除。更準確的讀出是高通量測序發展的重要方向。但現有技術對準確度的優化，多集中在優化化學反應本身以及后續圖像信號處理上，沒有從測序邏輯上進行革新。本專利技術涉及一種熒光切換性質的熒光團進行測序的方法。熒光切換性質的熒光團進行測序使用末端磷酸標記的核苷酸底物。熒光切換性質的熒光團的底物是通式為：在5’多磷酸末端或中間修飾有一種具有熒光切換性質的熒光團。其特點是，在4，5，6，或更多磷酸的脫氧核糖核苷酸(包括A，C，G，T，U以及其他核苷酸)的末端磷酸上或者中間磷酸上修飾有熒光切換的熒光團，并且在堿基和3’羥基上沒有標記。這個熒光團在修飾在磷酸上時與磷酸脫離時的吸收光譜與/或發射光譜不同。測序又連續的、相似的周期(cycle)構成。每個周期內包含進樣，反應和信號采集，和清洗未反應的反應物分子等步驟構成。在前人報道的方法中，每次進入一個堿基的底物分子，若不正確配對，則無反應發生；若正確配對，則聚合酶將底物分子連接至3‘尾端，并且釋放出多磷酸修飾的熒光分子，并且熒光光譜發生變化。若可以與homopolymer連續配對，則有成倍數的光譜改變。在實際應用中，傾向使用被標記在末端磷酸上無吸收，釋放狀態為高量子產率的熒光切換性質熒光團作為底物分子的修飾標記，例如甲基熒光素，含鹵代的甲基熒光素，DDAO，resorufin，CN104844674中涉及的熒光分子，等等。四種底物分子可以標記有不同的熒光分子。測序過程由ACGTACGT…或任意的循環或不循環進樣過程進樣，在有限的周期內含有底物分子的反應液進行測序反應。通過每個cycle得到的延伸信息，得到DNA序列。
技術實現思路
本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法：利用5’端多磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯改變；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反應液；使用酶將核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換。根據優選的技術方案，當連續測序的時候，優選進一步包括，利用清洗液清除殘留的反應液以及熒光分子，然后進行下一輪測序反應。根據優選的技術方案，在低溫下進入反應液，然后加熱到酶反應溫度，再檢測熒光信號。根據優選的技術方案，所述的核苷酸底物分子指的是含有A、G、C、T堿基的核苷酸分子，或者含有A、G、C、U堿基的核苷酸分子；其中所述的C是甲基化的C或者未甲基化的C。根據優選的技術方案，所述的5’端多磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子，指的是5’末端磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子。根據優選的技術方案，不同的核苷酸底物分子根據堿基不同，可以連接一種熒光團，進行單色測序；也可以連接多種熒光團，進行多色測序。根據優選的技術方案，所述的熒光切換性質指的是每一步的測序反應后，熒光信號相比于測序反應前有明顯增強或者有明顯減弱或者發射光頻率范圍有明顯改變。根據優選的技術方案，所述的熒光切換性質指的是每一步的測序反應后，熒光信號相比于測序反應前有明顯增強。根據優選的技術方案，將包含核苷酸底物分子的反應液用于測序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意兩種或三種的混合物；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意兩種或三種的混合物。根據優選的技術方案，將包含核苷酸底物分子的反應液用于測序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意一種；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意一種。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，利用前面任一項所述的方法進行測序，其特征在于，每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的至少一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的至少一種；將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息；其中，所述反應液組中，至少有一個反應液包含兩種或者三種不同的核苷酸分子。本專利技術涉及一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，利用前面任一項所述的方法進行測序，其特征在于，每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸；其中一個反應液中的核苷酸可以和待測核苷酸序列上的兩種堿基互補，另一個反應液中的核苷酸可以和待測核酸序列上的另外兩種堿基互補；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的第一個反應液；檢測、記錄熒光信息；然后通入同一套反應液組中的第二個反應液；檢測、記錄熒光信息；兩個反應液循環加入，通過熒光信息獲得待測核苷酸底物的編碼信息。根據優選的技術方案，當通入反應液之后，可以將進行反應的反應室封閉，然后檢測、記錄熒光信息。根據優選的技術方案，通入反應液后，用油充滿反應室外面的空間，從而將反應室隔離、封閉。根據優選的技術方案，所述的多磷酸核苷酸底物指的是具有4-8個磷酸分子的核苷酸；根據優選的技術方案，可以用一套反應液組進行一輪測序，也可以用兩套反應液組進行兩輪測序，也可以用三套反應液組進行三輪測序。根據優選的技術方案，步驟使用酶將具有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物上面的熒光團釋放中，所述的酶包括DNA聚合酶和/或堿式磷酸酶。根據優選的技術方案，用一套反應液組進行一輪測序，獲得簡并的編碼結果。根據優選的技術方案，用兩套反應液組進行兩輪測序，獲得堿基序列信息。根據優選的技術方案，用三套反應液進行三輪測序，在兩輪測序結果的基礎上，利用三輪測序間的互信息，進行錯誤校驗。根據優選的技術方案，所述的反應液中包含了所述酶，即將反應液通入待測的基因片段所在的反應區域的時候，其包含的酶將具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物上的熒光團釋放。根據優選的技術方案，所述的反應液和所述的酶不同時加入；本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，其特征在于：利用5’端多磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯改變；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反應液；使用酶將核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換。

【技術特征摘要】
1.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，其特征在于：利用5’端多磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子進行測序；所述的熒光切換性質指的是測序后熒光信號相比測序反應前有明顯改變；首先，將待測的核苷酸序列片段固定，然后通入含有核苷酸底物分子的反應液；使用酶將核苷酸底物上面的熒光團釋放，從而導致熒光切換。2.根據權利要求1所述的測序方法，其特征在于，進一步包括，利用清洗液清除殘留的反應液以及熒光分子，然后進行下一輪測序反應。3.根據權利要求1所述的測序方法，其特征在于，在低溫下進入反應液，然后加熱到酶反應溫度，再檢測熒光信號。4.根據權利要求1所述的測序方法，其特征在于，所述的核苷酸底物分子指的是含有A、G、C、T堿基的核苷酸分子，或者含有A、G、C、U堿基的核苷酸分子；其中所述的C是甲基化的C或者未甲基化的C。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的5’端多磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子，指的是5’末端磷酸修飾有熒光切換性質的熒光團的核苷酸底物分子。6.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，不同的核苷酸底物分子根據堿基不同，可以連接一種熒光團，進行單色測序；也可以連接多種熒光團，進行多色測序。7.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述的熒光切換性質指的是每一步的測序反應后，熒光信號相比于測序反應前有明顯增強或者有明顯減弱或者發射光頻率范圍有明顯改變。8.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述的熒光切換性質指的是每一步的測序反應后，熒光信號相比于測序反應前有明顯增強。9.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，將包含核苷酸底物分子的反應液用于測序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意兩種或三種的混合物；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意兩種或三種的混合物。10.根據前面任一項權利要求所述的方法，其特征在于，將包含核苷酸底物分子的反應液用于測序，所述的核苷酸底物分子是A、G、C、T核苷酸分子中的任意一種；或者所述的核苷酸底物分子是A、G、C、U核苷酸分子中的任意一種。11.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，利用權利要求1-9任一項所述的方法進行測序，其特征在于，每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組至少包括兩個反應液，每個反應液包含A、G、C、T核苷酸分子中的至少一種，或者每個反應液包含A、G、C、U核苷酸分子中的至少一種；將待測的核苷酸序列片段固定，通入一套反應液組中的一個反應液；檢測、記錄熒光信息；每次通入一個反應液，將同一反應液組中的其它反應液依次通入，并且每次檢測、記錄熒光信息；其中，所述反應液組中，至少有一個反應液包含兩種或者三種不同的核苷酸分子。12.一種利用具有熒光切換性質熒光團的核苷酸底物分子進行測序的方法，利用權利要求1-9任一項所述的方法進行測序，其特征在于，每輪測序使用一套反應液組，每套反應液組包括兩個反應液，每個反應液包含兩種不同堿基的核苷酸；其中一個...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃巖誼，陳子天，段海峰，
申請(專利權)人：北京大學，賽納生物科技北京有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11