一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法技術

一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，采用更為敏感的巢式PCR方法，單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定，通過在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，本發明專利技術巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。

【技術實現步驟摘要】
一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法
本專利技術具體涉及生物學
，具體涉及一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法。
技術介紹
蜱類是一種專性、非永久性寄生于陸生脊椎動物的醫學節肢動物，可通過直接叮咬和釋放毒素或攜帶病原體對宿主造成傷害。在進出境口岸蜱種類的調查中，對蜱蟲的鑒定及進化分型具有重要意義。目前，我國對于蜱種的鑒定主要依靠形態學方法，還沒有簡單、穩定的分子生物學手段。
技術實現思路
為了解決現有技術的缺陷及不足，本專利技術提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，能夠在低DNA模板濃度下快速、穩定的鑒定蜱蟲的種類。本專利技術采用的技術解決方案是：一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，包括設計的兩對特異性引物，具體為：T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。一種蜱蟲巢式PCR鑒定方法，包括以下步驟：(1)將需要檢測的蜱蟲樣品進行形態學上初步分型；(2)將經過形態學初步分型鑒定處理后的蜱蟲樣品，每種各取一只，進行基因組提取DNA，蜱蟲樣品無需RNA酶處理；(3)以蜱蟲樣品基因組DNA為模板，以所述的T18sF1+T18sR1為第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、雙蒸水，進行第一輪PCR；(4)以第一輪PCR產物DNA為模板，分別以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、雙蒸水，進行第二輪PCR；(5)取第二輪PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；(6)將第二輪PCR產物進行序列測定；(7)根據NCBI數據庫中記載的蜱蟲18srRNA基因序列，進行系統進化分析，最終得出蜱蟲樣品鑒定結果。所述的步驟(3)中的第一輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共10個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。所述的步驟(4)中的第二輪PCR反應條件為：預熱95℃，5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，共25個循環；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。所述的步驟(3)中蜱蟲樣品基因組DNA量為2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loadingbuffer為2.5μl，雙蒸水16.25μl。所述的步驟(4)中第一輪PCR產物DNA量為1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各為1μl，LAtaq酶為0.25μl，dNTP為2μl，10×Loadingbuffer為2.5μl，雙蒸水17.25μl。所述的步驟(5)中第二輪PCR產物量為2μl。本專利技術的有益效果是：本專利技術提供了一種蜱蟲巢式PCR特異性引物及蜱蟲巢式PCR鑒定方法，采用更為敏感的巢式PCR方法，單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定，通過在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，本專利技術巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。附圖說明圖1為18srRNA巢式PCR方法克隆示意圖。圖2為溫州口岸進口生牛皮中截獲蜱蟲形態學觀察。圖3為兩輪輪PCR產物分別經瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定結果。圖4為根據18srRNA基因序列對蜱蟲進行系統進化分析結果。具體實施方式根據蜱蟲18srRNA序列保守區設計兩對特異性引物T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。巢式PCR具體步驟(1)蜱蟲溫州口岸進口生牛皮中截獲蜱蟲，形態學上進行初步分型。(2)提取蜱蟲基因組形態學鑒定后，每一種蜱蟲取一只，按照基因組提取試劑盒(ZYMOL)說明進行基因組提取DNA，樣品無需RNA酶處理。(3)克隆策略克隆分兩步，按照圖1所示，①以蜱蟲基因組DNA為模板(2μl)，以T18sF1+T18sR1為第一套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(16.25μl)進行第一輪PCR，PCR程序為：②以第一輪PCR產物DNA為模板(1μl)，分別以T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(17.25μl)進行第一輪PCR，PCR程序為：(4)PCR產物鑒定取第二輪PCR產物2μl進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(5)測序將第二輪PCR產物送測序公司進行序列測定。(6)根據18srRNA基因序列進行基因型分析在NCBI數據庫中下載蜱蟲18srRNA基因序列，通過MEGA5.0軟件，進行系統進化分析實驗結果1、截獲蜱蟲形態學觀察根據形態學觀察，將所截獲蜱蟲分成10種，命名為T1～T10，如圖2所示。2、提取蜱蟲基因組每種蜱蟲取一只，按照基因組提取試劑盒(ZYMOL)說明進行基因組提取DNA，所提基因組DNA濃度為50～100ng/μl。3、巢式PCR結果以所獲得的蜱蟲基因組DNA為模板，經兩輪PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定產物，如圖3所示。以T18sF1+T18sR1為第一套引物，進行PCR，結果顯示T3、T4、T5、T8、T10均出現目的條帶，但其余5種蜱蟲未出現擴增產物條帶，如圖3a；以第一輪產物為模板，進行第二輪巢式PCR后，10種測試樣品均出現目的條帶，如圖3b。將克隆產物送公司進行測序。4、根據18srRNA基因序列進行基因型分析測序產物，通過拼接后，為18srRNA基因序列。與NCBI中已公布的蜱蟲18srRNA基因序列進行比對分析，通過MEGA5.0軟件，進行系統進化分析，結果表明，T1、T2、T3、T4、T8可能為Amblyomma或Aponomma的亞種；T5、T9與Boophilus和Rhipicephalus序列相似性為100％；T6、T10為Boophilus和Rhipicephalus的亞種，如圖4所示。本專利技術通過建立了更為敏感的巢式PCR方法。單蜱蟲甚至蜱蟲的部分組織器官提取的微量基因組DNA即可作為模板進行鑒定。現有技術對于蜱蟲的分型主要通過形態學觀察，本專利技術是在基因水平上進行蜱蟲的分型、系統進化分析，與形態學方法具有本質的區別。本專利技術中，巢式PCR方法第一輪只需10個循環，第二輪需25個循環，縮短了簡單的兩輪普通PCR所需時間。以上所述僅是本專利技術的優選實施方式，本專利技術的保護范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本專利技術思路下的技術方案均屬于本專利技術的保護范圍。應當指出，對于本本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，其特征在于，包括設計的兩對特異性引物，具體為：T18sF1：5`?GTAGTCATATGCTTGTCTC?3`；T18sR1：5`?TCCGCAGGTTCACCTACGGA?3`；T18sF2：5`?CAARTGTCTGCCYTATCAACT?3`；T18sR2：5`?CTTCCGTCAATTCCTTTAAG?3`。

【技術特征摘要】
1.一種蜱蟲巢式PCR特異性引物，其特征在于，包括設計的兩對特異性引物，具體為：T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。2.一種采用權利要求1所述的特異性引物的蜱蟲巢式PCR鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將需要檢測的蜱蟲樣品進行形態學上初步分型；(2)將經過形態學初步分型鑒定處理后的蜱蟲樣品，每種各取一只，進行基因組提取DNA，蜱蟲樣品無需RNA酶處理；(3)以蜱蟲樣品基因組DNA為模板，以權利要求1中所述的T18sF1+T18sR1為第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、雙蒸水，進行第一輪PCR；(4)以第一輪PCR產物DNA為模板，分別以權利要求1中所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1為第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loadingbuffer、雙蒸水，進行第二輪PCR；(5)取第二輪PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；(6)將第二輪PCR產物進行序列測定；(7)根據NCBI數據庫中記載的蜱蟲18srRNA基因序列，進行系統進化分析，最終得出蜱蟲樣品鑒定結果。3.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王素華，閆寶龍，帥江冰，吳紹強，
申請(專利權)人：溫州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，
類型：發明
國別省市：浙江,33