一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法，該方法采用CTAB法從木薯葉片中提取木薯基因組DNA，設計一對特異引物擴增包含

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法
本專利技術(shù)屬于農(nóng)業(yè)生物
，具體涉及一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法。
技術(shù)介紹
木薯（ManihotEsculentaCrantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100余個國家或地區(qū)，是世界三大薯類作物之一，熱區(qū)第三大糧食作物，全球第六大糧食作物，被譽為“淀粉之王”。。木薯用途廣泛，除作糧食外，還是重要的工業(yè)原料，如木薯塊根淀粉、干片可制變性淀粉、酒精和山梨醇等，而這些產(chǎn)品又是食品、醫(yī)藥、紡織、造紙等產(chǎn)業(yè)的重要原料。木薯塊根具有較高的營養(yǎng)價值。相關(guān)研究表明(魏艷，2014)，薯肉的干物率，淀粉含量分別是甘薯的0.8～3.9倍、0.7～1.3倍，是馬鈴薯的1.7～3.7倍、1.7～4.0倍，其維生素C、粗蛋白和可溶性糖含量可與甘薯媲美。鈣、鎂、鐵含量分別是馬鈴薯的9.4～180.7倍，鋅含量是甘薯的0.3～5.8倍。因此，木薯塊根的營養(yǎng)價值和礦物質(zhì)含量與馬鈴薯、甘薯相當，甚至比馬鈴薯、甘薯還更具營養(yǎng)價值。木薯不僅營養(yǎng)豐富，還具有良好的保健功能。食用木薯低脂肪、低糖、低鹽，且飽腹感強，利于抑制體重增長，預防肥胖。鮮薯中富含膳食纖維，有助于改善腸胃微環(huán)境，預防消化系統(tǒng)疾病。然而我國木薯食用品種缺乏，推廣面大的品種僅有華南9號等，迫切需要選育更多更好的食用木薯品種。到目前為止，木薯育種策略主要集中為資源引進與系統(tǒng)選育，雜交或?qū)嵣N選育，但育種周期相對較長，效率低下，分子標記輔助育種為木薯品種選育或資源篩選提供了一條高效的途徑。酶切擴增多態(tài)性序列(CleavedAmplifiedPolymorphicSequence,CAPS)是利用特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種檢測SNP位點的DNA標記(Konieczny,1993)，自建立以來受到了廣大研究者的重視，現(xiàn)已成為生物研究的重要分子標記技術(shù)，目前被廣泛應用于輔助品種選育中，具有共顯性、低成本、操作簡單等優(yōu)點。其基本原理是根據(jù)己知位點的序列設計特異性的PCR引物(18-25bp)，然后擴增該位點的DNA片段，用限制性內(nèi)切酶對片段進行切割得到產(chǎn)物，利用凝膠電泳使酶切片段分開并分析位點變化情況。Welsch等(2010)針對木薯塊根維生素A含量開展研究，發(fā)現(xiàn)木薯塊根肉色黃與白，即維生素A含量高低，由八氫番茄紅素基因PSY2中的一個SNP位點變異決定，該突變位點的野生型為AGAT，突變型為AGCT，AGCT是限制性內(nèi)切酶AluI的酶切位點。根據(jù)這一序列特征，我們開發(fā)出一個基于AluI內(nèi)切酶位點的CAPS標記來區(qū)分黃肉木薯與白肉木薯，并將其應用于黃色肉質(zhì)食用木薯種質(zhì)鑒定和篩選，這樣不僅可以為拓寬木薯選育途徑提供重要信息，還可以豐富木薯種質(zhì)資源，選育食用木薯優(yōu)良品種。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于：針對上述存在的不足，本專利技術(shù)提供了一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法。本專利技術(shù)可用于木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記輔助育種，可實現(xiàn)在苗期時通過抽提葉片DNA進行分子標記分析檢測，進而準確鑒別木薯塊根肉質(zhì)顏色，能快速選擇符合育種目標的塊根肉質(zhì)顏色材料進行大田移栽，從而提高育種效率，加快育種進程。為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法，由以下步驟組成：（1）采用CTAB法從木薯葉片中提取木薯基因組DNA，根據(jù)PSY2基因的DNA序列，設計一對特異引物可以擴增包含SNP2位點的260bp核苷酸序列，然后用該特異引物對木薯基因組DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；（2）利用限制性內(nèi)切酶AluI酶切步驟（1）得到的PCR擴增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；（3）使用濃度為3.0%瓊脂糖凝膠對步驟（2）的酶切產(chǎn)物進行電泳分離，然后根據(jù)電泳結(jié)果進行木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色判定，塊根肉質(zhì)顏色判定標準為：若電泳后可見2條帶——194bp和66bp，或電泳后見1條帶——194bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為黃色；若電泳后可見2條帶——172bp和66bp，或電泳后見1條帶——172bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為白色；若是電泳后可見3條帶——194bp、172bp和66bp，或電泳后見2條帶——194bp和172bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為淺黃色。其中優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟（1），所述特異引物核苷酸序列為：上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAAGG-3’。進一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟（1），所述PCR擴增的反應體系為25μL，由下列成分組成：10×PCRbuffer反應緩沖液2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、正向引物（10μmol/L）0.5μL、反向引物（10μmol/L）0.5μL、Taq（5U/μL）0.5μL、模板DNA（50ng/μL）1μL。進一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟（1），所述PCR擴增的條件為：先在94℃下預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃下保存。進一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟（2），所述酶切體系為15μL，其中包含：PCR產(chǎn)物10μL、10×Lbuffer1.5μL、限制性內(nèi)切酶AluI3.0U，其余為ddH2O。進一步優(yōu)選的技術(shù)方案是，在步驟（3），所述電泳方法為：用3.0%瓊脂糖凝膠電檢測泳，緩沖液為0.5×TBE，上樣量為15μL，在5V/cm恒壓下電泳1.5h。本專利技術(shù)的原理為：PlantCell（2010）文章報道PSY2基因的SNP2位點可決定栽培木薯的塊根肉質(zhì)是黃色還是白色，該突變位點的野生型為AGAT，突變型為AGCT，AGCT是限制性內(nèi)切酶AluI的酶切位點，因此根據(jù)這一序列特征，我們開發(fā)出一個基于AluI的CAPS標記來區(qū)分黃肉木薯與白肉木薯。根據(jù)PSY2基因的DNA序列，設計一對特異引物可以擴增包含SNP2位點的長度為260bp的序列，該260bp核苷酸序列為：GCTTCACACATAACGCCAAC（AGCT）TTAGATAGGTGGGAAGCAAGGTTGGAAGATATGTTT（AGAT）CGAGGTCGTCCCTTTGATATGCTTGATGCTGCTTTATCAGATACAGTTACTAAATTTCCTGTTGATATTCAGGTTAGCCATTATTAAATCAAGTCTTTAACACTACATAAACTTTTAAACAATCAAAACTACAGCTTATAATGCCATTTCTGTGTTTGTTTCTCATTTTGGCTGATTCCTTTGAACATCTGTTTCAGCCA，該260bp序列中存在2個AGCT位點，當限制性內(nèi)切酶AluI酶切PCR產(chǎn)物時，若產(chǎn)物是AGAT黃色純合型，則電泳后可見2條帶：194bp和66bp；如果產(chǎn)物是AGCT白色純合型，則電泳后也可見2條帶：172bp和66bp；若產(chǎn)物是AGAT/AGCT淡黃色雜合型，則電泳后可見3條帶：194bp，172bp和66bp；而22bp在膠上基本不可見。綜上所述，本專利技術(shù)由于采用本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法，其特征在于，由以下步驟組成：（1）采用CTAB法從木薯葉片中提取木薯基因組DNA，根據(jù)

【技術(shù)特征摘要】
1.一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法，其特征在于，由以下步驟組成：（1）采用CTAB法從木薯葉片中提取木薯基因組DNA，根據(jù)PSY2基因的DNA序列，設計一對特異引物可以擴增包含SNP2位點的260bp核苷酸序列，然后用該特異引物對木薯基因組DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；（2）利用限制性內(nèi)切酶AluI酶切步驟（1）得到的PCR擴增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物；（3）使用濃度為3.0%瓊脂糖凝膠對步驟（2）的酶切產(chǎn)物進行電泳分離，然后根據(jù)電泳結(jié)果進行木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色判定，塊根肉質(zhì)顏色判定標準為：若電泳后可見2條帶——194bp和66bp，或電泳后見1條帶——194bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為黃色；若電泳后可見2條帶——172bp和66bp，或電泳后見1條帶——172bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為白色；若是電泳后可見3條帶——194bp、172bp和66bp，或電泳后見2條帶——194bp和172bp，則該木薯材料的塊根肉質(zhì)顏色為淺黃色。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色的分子標記方法，其特征在于：在步驟（1），所述特異引物核苷酸序列為：上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAA...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：嚴華兵，周慧文，謝向譽，曹升，尚小紅，陳新，陸柳英，曾文丹，
申請(專利權(quán))人：廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，
類型：發(fā)明
國別省市：廣西,45