一種檢測豬細菌性腸炎病原的多重PCR特異性引物及其應用制造技術

本發明專利技術涉及動物醫學的分子生物學和生產領域，具體涉及檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:6所示，特異性、重復性好，靈敏度高。本發明專利技術還公開了以所述引物建立的檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的方法；能夠快速區分大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的單獨或混合感染導致的豬腸炎；能夠快捷、有效地鑒別診斷，有利于制定針對性的防控措施，對臨床生產豬細菌性腸炎的免疫防控，保障養豬生產平穩進行。

【技術實現步驟摘要】
一種檢測豬細菌性腸炎病原的多重PCR特異性引物及其應用
本專利技術涉及動物醫學的分子生物學領域，具體涉及檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物及其應用。
技術介紹
豬細菌性腸炎在臨床生產中長期存在，并導致生長速度減慢和大量死亡。引起豬腸炎的病原主要為大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌，其中大腸桿菌導致仔豬黃白痢、斷奶仔豬腹瀉和腸道水腫等；沙門氏菌導致仔豬副傷寒和育肥豬拉稀等；產氣莢膜梭菌導致仔豬紅痢和肥豬階段腸道脹氣等。豬細菌性腸炎病程短，傳播快，病情發展迅速，死亡率高。豬大腸桿菌在豬群中引起很多疾病，包括新生仔豬腹瀉、斷奶仔豬腹瀉和腸道黏膜下層水腫。由于發病率、死亡率和體重降低的增加，以及治療、疫苗和飼料添加劑的成本增加，大腸桿菌引起的腹瀉和水腫病造成了巨大的經濟損失。豬沙門氏菌多爆發于斷奶的幼崽豬群，臨床癥狀主要表現為小腸結腸炎、腹瀉及脫水。本病常發生于感染了大劑量沙門氏菌，免疫抑制，且體質虛弱及衛生條件差的豬群。臨床急性發病豬，其排菌可達每克糞便含106個豬霍亂沙門氏菌(SmithHW,JonesJET.1967.JPathol93:141-156.)或107個鼠傷寒沙門氏菌(GutzmannF,LaytonH,SimiinsK,etal.1976.AmJVetRes37:649-655.)。豬產氣莢膜梭菌病在世界范圍內流行，其病原梭菌是一類嚴格厭氧的革蘭氏言行產芽胞桿菌，其中引起腸炎的主要為C型和A型產氣莢膜梭菌。其中C型產氣莢膜梭菌病例通常出現在仔豬出生以后3天，增殖快，世代間隔短，在數小時內，可以增殖到108-109個/g(OhnunaY,KondoH,etal.1992.JJpnVetDiagnInvest14:258-259)，感染仔豬迅速轉變為虛脫，勉強運動，然后很快轉并為瀕死期，多數病例會在出生后12-36h死亡。A型產氣莢膜收集是豬腸道內正常微生物區細的組成部分，一旦條件適宜就大量增殖，引起新生仔豬、偶爾也可以引起斷奶仔豬的腸道疾病。大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌這三種病原菌也是人畜共患的感染原，人群極易通過接觸或食用帶菌的食物而感染，尤其是對老人小孩人群，感染后會引發消化道炎癥、出血性腹瀉、敗血癥、傷寒等病癥，傷害極大。目前實驗室對大腸桿菌和沙門氏菌進行有氧培養，對產氣莢膜梭菌進行厭氧培養，并且分別進行三種病原菌的生化試驗或者單病原PCR鑒定。培養過程耗時較長且目標盲目，尤其厭氧培養對硬件和操作熟練度要求高，而單病原PCR鑒定需要對三種病原分別進行檢測耗時長試劑使用量大。綜上所述，現有技術還存在較大不足。
技術實現思路
有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物及利用該引物建立的檢測方法，特異性強和敏感性高，可滿足臨床上簡便、快速、準確進行區分鑒定的要求，為臨床生產對該病的免疫防控提供依據。為達到上述目的，本專利技術采用以下技術方案：一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:6所示。進一步的，所述引物的模板基因為大腸桿菌uidA1和uidA2基因、沙門氏菌invA1和invA2基因、產氣莢膜梭菌clo1和clo2基因。一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的試劑盒，包含上述多重PCR特異性引物。進一步的，所述試劑盒還包括：PCR預混液、無菌雙蒸水；所述PCR預混液包括：DNA聚合酶、pH8.3BufferTris-HCl、KCl、MgCl2、dNTPMixture。進一步的，所述特異性引物在豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌檢測中的應用。一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的方法，包括：利用所述引物對待檢樣品進行PCR擴增；收集擴增產物進行電泳實驗；判讀電泳結果。所述PCR反應體系包括：PCR預混液12.5μL、引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各1μL、引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各0.5μL、引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6各1.5μL、無菌雙蒸水6.5μL；所述引物的濃度均為10pmol；所述PCR反應條件為：93～95℃預變性5min～10min；93～95℃變性30s，48～56℃退火30s，70～72℃延伸60s，30個循環；最后70～72℃終延伸7min～10min。進一步的，所述PCR反應條件為：95℃預變性10min；然后95℃30s，55℃30s，72℃60s，共進行30次循環；最后72℃延伸7min。進一步的，所述PCR預混液包括：DNA聚合酶1.25U/25μL、pH8.3BufferTris-HCl20mM、KCl100mM、MgCl23mM、dNTPMixture各0.4mM。進一步的，所述電泳檢測為瓊脂糖凝膠電泳檢測。本專利技術有益效果：本專利技術實施例的有益效果是：本專利技術根據大腸桿菌uidA基因、沙門氏菌invA基因和產氣莢膜梭菌a毒素基因的分析并設計引物能擴增不同長度片段的這一特點，建立一種用多重PCR方法快速鑒別診斷引起豬腸炎性的大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌單獨或者混合感染的方法，特異性強和敏感性高，可滿足臨床上簡便、快速、準確進行區分鑒定的要求，為臨床生產對該病的免疫防控提供依據。附圖說明圖1：樣品檢測電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分別為陰性對照、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌+沙門氏菌、產氣莢膜梭菌+大腸桿菌、沙門氏菌+大腸桿菌、產氣莢膜梭菌+大腸桿菌+大腸桿菌。圖2：豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌多重PCR擴增方法的特異性檢驗電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分別為陰性對照、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬巴氏桿菌、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌。圖3：豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌多重PCR擴增方法檢測大腸桿菌敏感性檢驗電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7分別表示待檢樣品中大腸桿菌DNA含量為0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。圖4：豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌多重PCR擴增方法檢測沙門氏菌桿菌敏感性檢驗電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7分別表示待檢樣品中沙門氏菌DNA含量為0、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。圖5：豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌多重PCR擴增方法檢測產氣莢膜梭菌敏感性檢驗電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分別表示待檢樣品中產氣莢膜梭菌DNA含量為0、103CFU、104CFU、105CFU、106CFU、107CFU、108CFU、109CFU。圖6：豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌多重PCR擴增方法檢測模擬豬腸道感染的大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌敏感性檢驗電泳圖，泳道1、2、3、4、5、6、7、8分別表示待檢樣品中大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌樣本DNA含量各為0、103CF本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:6所示。

【技術特征摘要】
1.一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的多重PCR特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:6所示。2.根據權利要求1所述的特異性引物，其特征在于，所述引物的模板基因為大腸桿菌uidA1和uidA2基因、沙門氏菌invA1和invA2基因、產氣莢膜梭菌clo1和clo2基因。3.一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1或2所述的特異性引物。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：PCR預混液、無菌雙蒸水；所述PCR預混液包括：DNA聚合酶、pH8.3BufferTris-HCl、KCl、MgCl2、dNTPMixture。5.權利要求1或2所述特異性引物在豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌檢測中的應用。6.一種檢測豬細菌性腸炎病原大腸桿菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的方法，包括：利用所述引物對待檢樣品進行PCR擴增；收集擴增產物進行電泳實驗；判讀電泳結果；所述PCR反應體系包...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王雷，宋延華，潘永飛，
申請(專利權)人：廣東溫氏食品集團股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44