一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物及應用制造技術

本發明專利技術屬于生物檢測醫學分子技術領域，涉及一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物及應用，具體涉及一種用于FokI(rs2228570)這個SNP位點核苷酸多態性的檢測引物及應用，所述擴增引物包括根據FokI(rs2228570)位點的單核苷酸多態性設計的特異性引物。本發明專利技術方法采用限制性內酶切的方法檢測VDR基因準確性高，結果直觀，特異性好，假陽性假陰性率低，是一種判斷兒童鈣吸收的簡單準備的新方法，不僅如此，本發明專利技術所提供的用于檢測兒童鈣吸收基因型多態性的PCR擴增引物、檢測試劑盒及其檢測方法具有很高的應用價值，操作簡單方便，一起設備要求低，適應性廣，特別適合推廣應用。

【技術實現步驟摘要】
一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物及應用
本專利技術屬于生物檢測醫學分子
，涉及一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物及應用，具體涉及一種用于FokI(rs2228570)這個SNP位點核苷酸多態性的檢測引物及應用。
技術介紹
鈣是人體所必需的礦物質營養素，所有的細胞都需要鈣。人類的健康離不開鈣。人體內99％以上的鈣都分布于骨骼和牙齒中,其余的1％中一半與蛋白質結合，一半以離子狀態存在于軟組織、細胞外液及血液。這部分鈣與骨骼鈣維持動態平衡，是維持體內正常狀態所必需的。體內有相當強大保留鈣和維持細胞外液中鈣濃度的機制，因為鈣生理學功能對生命非常重要，即使當飲食鈣嚴重缺乏或機體發生鈣異常丟失時，可通過相同機制使骨脫礦化，以糾正甚至是輕微低鈣血癥，而保持血鈣穩定。影響人體每日吸收的鈣數量最決定性的器官就是小腸，維生素D所刺激產生的Ca運輸蛋白(TRPV-5,TRPV-6)，會將在小腸內腔的Ca離子主動運輸至小腸的絨毛細胞(enterocytecell)內，絨毛細胞再將鈣離子經由鈣泵運輸到血液中。維生素D，又通稱為可以幫助生物體吸收鈣質的固醇類物質，在小腸對鈣的吸收中扮演重要的角色，它可增加小腸細胞膜和細胞質的鈣結合蛋白質的總量。維生素D缺乏的兒童會因為鈣吸收不足而易患有軟骨病。基因檢測已被證明是預測兒童天賦的有效手段。通過對鈣吸收相關某些基因的檢測可以對鈣吸收進行預測。幫助家長提早發現孩子可能存在的鈣吸收高風險情況，從而引起足夠的重視。VDR是維生素D受體(VitaminDreceptor)，其作用是結合在Ca運輸蛋白基因的上游轉錄調控元件上，在腎臟中VDR會調節維生素D與Ca運輸蛋白基因進一步結合，將其磷酸化，制造出Ca運輸蛋白，幫助人體從小腸中吸收鈣離子。因此VDR基因的多態性與鈣吸收率有顯著的相關性。CN103255211A公開了一種預測優秀冰雪運動員身高的分子生物學方法。通過檢測維生素D受體基因遺傳多態性，即對維生素D受體基因BsmI、ApaI和FokI三個單核苷酸多態性位點的基因型進行命名并檢測相應基因型的概率來預測優秀冰雪運動員的最適身高，但其并沒有公開可用于檢測鈣吸收的情況。目前檢測單核苷酸多態性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger測序等方法。PCR-RFLP操作復雜耗時，并且結果可信度差。PCR-RFLP擴增條件要求嚴格，操作繁瑣?；蛐酒焖俑咝В湓靸r高。Sanger測序費用較高，且雜合體不易分型。目前市場上兒童補鈣的產品很多，但補充鈣后兒童能不能很好的吸收鈣也至關重要，因此檢測VDR基因至關重要。
技術實現思路
本專利技術為了克服上述方法的缺陷，提供一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物及應用，本申請方法采用限制性內切酶的方法檢測VDR基因上的單核苷酸多態性，準確性高，特異性好，假陽性假陰性率低，操作簡單方便，儀器設備要求低，適應性廣。為達到此專利技術的目的，本專利技術采用以下技術方案：第一方面，本專利技術提供一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物，其特征在于，所述擴增引物包括根據FokI(rs2228570)位點的單核苷酸多態性設計的特異性引物。本專利技術中，VDR基因上的一個單核苷酸多態性位點rs2228570的多態性與鈣吸收高度相關，采用限制性內酶切的方法檢測VDR基因準確性高，特異性好，假陽性假陰性率低。根據本專利技術，所述FokI(rs2228570)位點的特異性引物的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示；FokI(rs2228570)上游引物(SEQIDNO.1)：GCGGAACAGCTTGTCCACCC；FokI(rs2228570)下游引物(SEQIDNO.2)：GCTCAGAACTGCTGGAGTGG。第二方面，本專利技術提供了檢測兒童鈣吸收基因多態性的試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的擴增引物。根據本專利技術，所述試劑盒還包括緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性內切酶。本專利技術中，所述緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性內切酶都是常規的PCR試劑，本領域技術人員可以根據需要對濃度進行調節，在此不做特殊限定。第三方面，本專利技術提供一種兒童鈣吸收基因多態性的檢測方法，所述檢測方法包括使用如第一方面所述的擴增引物或如第二方面所述的試劑盒。根據本專利技術，包括如下步驟：(1)采集待檢樣本，提取樣本DNA；(2)使用如權利要求1或2所述擴增引物進行PCR擴增反應；(3)使用限制性內切酶處理步驟(2)得到的擴增產物；(4)向步驟(3)處理后的擴增產物進行凝膠電泳分析。根據本專利技術，步驟(1)所述的提取樣本DNA的具體步驟如下：取口腔黏膜樣本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴過夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，1000-15000r/min離心1-5min，取上清液，即得所述待測樣本DNA。所述的水浴溫度例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃或53℃，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。所述煮沸時間例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。所述置于冰上的時間例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。所述離心的轉速例如可以是10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min或15000r/min，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。所述離心的時間例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。本專利技術中，所述蛋白酶K的濃度為10-30mg/mL，例如可以是10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、28mg/mL或30mg/mL，優選為15-25mg/mL，進一步優選為20mg/mL，以及上述數值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本專利技術不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。在本專利技術一個具體實施例中，所述提取樣本DNA的具體步驟如下：取口腔粘膜拭子，在口腔內側反復擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于Chelex100液150μl的1.5ml離心管中，使其浸沒標本，加入20mg/mL蛋白酶K20μL，50℃水浴過夜，煮沸10min，置于冰上3min，12000r/min離心2min，取上清液，即得所述待測樣本DNA。本專利技術中，所述Chelex100液，按照5％(w/v)的濃度配置。根據本專利技術，步驟(2)所述PCR擴增反應的條件為：(a)94℃預變性1min，1循環；(b)95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物，其特征在于，所述擴增引物包括根據FokI(rs2228570)位點的單核苷酸多態性設計的特異性引物。

【技術特征摘要】
1.一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的擴增引物，其特征在于，所述擴增引物包括根據FokI(rs2228570)位點的單核苷酸多態性設計的特異性引物。2.根據權利要求1所述的擴增引物，其特征在于，所述FokI(rs2228570)位點的特異性引物的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示。3.一種檢測兒童鈣吸收基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1或2所述的擴增引物。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性內切酶。5.一種兒童鈣吸收基因多態性的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括使用如權利要求1或2所述的擴增引物或如權利要求3或4所述的試劑盒。6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)采集待檢樣本，提取樣本DNA；(2)使用如權利要求1或2所述擴增引物進行PCR擴增反應；(3)使用限制性內切酶處理步驟(2)得到的擴增產物；(4)向步驟(3)處理后的擴增產物進行凝膠電泳分析。7.根據權利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)所述的提取樣本DNA的具體步驟如下：取口腔黏膜樣本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴過夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，10000-15000r/min離心1-5min，取上清液，即得所述待測樣本DNA；優選地，所述蛋白酶K的濃度為10-30mg/mL，優選為15-25mg/mL，進一步優選為20mg/mL。8.根據權利要求5-7中任一項所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述PCR擴增反應的條件為：(a)94℃預變性1min，1循環；(b)95℃變性30s、60℃退...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉鵬飛，王菁蕊，段婷，韓雪，
申請(專利權)人：天津脈絡醫學檢驗有限公司，
類型：發明
國別省市：天津,12