一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法技術

本發明專利技術屬于生物工程技術領域，提供了一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法，以亞硝化細菌的專屬特征性基因?氨單加氧酶基因為模板設計合成一對特異性引物，并以亞硝化細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，通過對PCR擴增條件優化，然后對PCR擴增產物進行瓊脂糖水平電泳，根據電泳泳道中條帶的有無及大小，判斷該細菌菌株是否屬于亞硝化細菌或者混合菌群中是否含有亞硝化細菌。本方法是以用氨單加氧酶基因為模板設計的特異引物為PCR擴增引物，實驗結果特異性強，實驗操作簡單，結果可靠性高，并通過優化PCR擴增條件縮短了亞硝化細菌的鑒定周期，較常規PCR擴增時間縮短26％以上，為亞硝化細菌種群的鑒定提供了一個快速、有效的鑒定方法。

【技術實現步驟摘要】
一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法
本專利技術屬于生物工程
，提供了一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法。
技術介紹
近年來，我國環境污染日益嚴重，成為當前人類面臨的一個重大問題。特別是工業及生活污水中的氨氮污染，可以引起水體富營養化和水體生態系統紊亂等一系列問題。生物硝化脫氮是目前水處理領域研究的熱點，由硝化作用和反硝化作用共同完成，其中硝化作用分為兩個階段，首先由亞硝化細菌把氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，然后由硝化細菌把亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。但是目前已運行的生物硝化脫氮池達標率不高，解決問題的關鍵在于提高池內亞硝化細菌和硝化細菌的生物量及其活性，這就需要一個快速檢測亞硝化細菌和硝化細菌的方法，用以指導生物硝化池的運行。通常所用的亞硝化細菌鑒定方法一般為16SrDNA擴增法，早在很久之前該方法就普遍用于細菌菌種的鑒定。該法以細菌16SrDNA區域通用引物作為擴增引物，PCR擴增結束后要把PCR產物測序、比對后才只能將菌種鑒定到屬，這樣用通用引物進行的PCR擴增結果特異性不高，而且還延長了菌種鑒定的周期，達不到快速檢測的目的。因此找尋針對亞硝化細菌PCR鑒定方法的最佳PCR條件成為本領域技術人員難以解決的問題。
技術實現思路
本專利技術針對上述技術存在的不足，提供了一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法，以亞硝化細菌的專屬特征性基因-氨單加氧酶基因(amoA)為模板設計合成一對特異性引物，并以亞硝化細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，通過對PCR擴增條件優化，然后對PCR擴增產物進行瓊脂糖水平電泳，根據電泳泳道中條帶的有無及大小，判斷該細菌菌株是否屬于亞硝化細菌或者混合菌群中是否含有亞硝化細菌。本方法是以用氨單加氧酶基因為模板設計的特異引物為PCR擴增引物，實驗結果特異性強，實驗操作簡單，結果可靠性高，并通過優化PCR擴增條件縮短了亞硝化細菌的鑒定周期，較常規PCR擴增時間縮短26％以上，為亞硝化細菌種群的鑒定提供了一個快速、有效的鑒定方法。現有技術中PCR擴增在PCR儀內完成，而擴增條件基本一致，這已成為了本領域的基本常規操作，但是專利技術人發現針對本專利技術的目的，常規的PCR擴增條件難以適應，存在準確率較低且擴增時間較長的缺陷，難以適應本專利技術的要求，故此專利技術人針對這一缺陷對PCR擴增條件進行了改進。本專利技術的具體技術方案如下：⑴引物的設計與合成：以亞硝化細菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據引物設計原則，利用primer5.0軟件設計并合成一對特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提取：采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌種的基因組DNA；⑶PCR擴增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴增模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補足25ul⑷PCR擴增反應條件：PCR擴增體系準備好后，以引物的退火溫度為53℃設定PCR擴增的反應條件，具體反應條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：觀察是否含有大小為526bp目標條帶，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有則判定為試樣中含有亞硝化細菌。與現有技術相比，本專利技術的最大特點就是針對亞硝化細菌設計了特異性引物，更為主要的就是針對本專利技術的目的優化了常規的PCR擴增條件，利用本專利技術提供的這種方法，較之常規的檢測方法具有靈敏度高，特異性強，操作簡單快捷，檢測時間短，準確性高等優點；與現有技術對比可知，本專利技術的PCR擴增條件中的溫度較之常規擴增溫度均有所降低，且循環數由常規的30個降低到25個，且各步驟時間都較之現有技術有明顯的縮減，在這種情況下，其準確度依然高于采用16SrDNA法常規擴增條件(94℃3min，94℃30s、55℃30s、72℃50s(30個循環)，然后72℃10min)，可見這種擴增條件對于本專利技術的要求是最佳的選擇方案，總體時間較之現有技術縮短了26％，且準確度大大提高。綜上所述，本專利技術是以用氨單加氧酶基因為模板設計的特異引物為PCR擴增引物，實驗結果特異性強，實驗操作簡單，結果可靠性高，并通過優化PCR擴增條件縮短了亞硝化細菌的鑒定周期，較常規PCR擴增時間縮短26％以上，為亞硝化細菌種群的鑒定提供了一個快速、有效的鑒定方法。附圖說明圖1為樣品1PCR結果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品1擴增產物；圖2為樣品2PCR結果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品2擴增產物；圖3為樣品3PCR結果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品3擴增產物；圖4為比較例中16srDNA常規鑒定法的鑒定結果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品3擴增產物；可見其擴增產物為一條大小為1424bp的目標條帶，因此只能定性檢測細菌的存在，無法確定所檢測細菌的種類。具體實施方式以下通過實施例形式的具體實施方式，對本專利技術的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本專利技術上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本專利技術上述內容所實現的技術均屬于本專利技術的范圍，除特殊說明外，下述實施例中均采用常規現有技術完成。實施例1一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法樣品來源：石化常減壓裝置污水，經去酚脫硫處理后進入生化處理池，選用此處理池廢水為樣品1。樣品檢測：⑴引物的設計與合成：以亞硝化細菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據引物設計原則，利用primer5.0軟件設計并合成一對特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提取：采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取上述樣品1廢水中的基因組DNA；⑶PCR擴增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴增模板，進行PCR擴增，PCR擴增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補足25ul⑷PCR擴增反應條件本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法，其特征在于：PCR擴增反應條件具體如下：

【技術特征摘要】
1.一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法，其特征在于：PCR擴增反應條件具體如下：2.根據權利要求1所述的亞硝化細菌的PCR鑒定方法，其特征在于：具體步驟如下：⑴引物的設計與合成：以亞硝化細菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因為模板，根據引物設計原則，利用primer5.0軟件設計并合成一對特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提取：采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌種...

【專利技術屬性】
技術研發人員：車樹剛，馬韻升，劉圣鵬，馬娜娜，張心青，冉新新，郭南南，李琦，任曉燕，張蕭蕭，
申請(專利權)人：黃河三角洲京博化工研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：山東,37