一種用于鑒別五靈脂的引物組、試劑盒及檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種用于鑒別五靈脂的引物組、試劑盒和檢測方法，其引物組序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。本發明專利技術以五靈脂的一對特異性引物對待測樣本DNA提取物進行PCR擴增，為五靈脂的檢測和鑒定提供準確的靶標位點，快速準確進行鑒定。本發明專利技術的檢測方法簡便，快捷，有效，能夠從干燥的五靈脂糞便中快速準確的鑒定出五靈脂。

【技術實現步驟摘要】
一種用于鑒別五靈脂的引物組、試劑盒及檢測方法
本專利技術涉及一種檢測方法，具體涉及一種用于鑒別五靈脂的引物組、試劑盒及檢測方法。屬于分子生物

技術介紹
五靈脂為復齒鼯鼠的干燥糞便，始載于《開寶本草》，云：“出北地。此是寒號蟲糞也”。五靈脂性味甘溫，無毒，入肝經，具有疏通血脈，散瘀止痛的功效，主治血滯、經閉、腹痛；胸脅刺痛跌撲腫痛和蛇蟲咬傷等癥，是婦科要藥。目前，市場上發現五靈脂的質量參差不齊，來源比較混亂，主要來源于鼠兔科等10余種動物，據報道，部分不法分子甚至人為加工成品來冒充正品五靈脂。相對于不同科屬的動物糞便區分相對容易，而對于鼯鼠科的動物糞便和人工加工品在外觀和質地上都與正品五靈脂極其相似，形態鑒別存在難度。這些偽品的存在不僅危害整個中草藥五靈脂市場，而且會損害患者的健康。因此，急需建立一種快速鑒別五靈脂真偽的方法，為五靈脂的檢測和監督提供技術支撐。傳統的鑒別五靈脂的方法主要是通過形態學和顯微鏡鑒別，然而對于形態相近的糞便很難用傳統的方法來辨別真偽。利用動物通用引物COI序列進行鑒定，會出現不同程度套峰，致使檢測結果不準確，并且PCR擴增困難，所以急需建立一種高效、可靠地方法鑒別五靈脂真偽。
技術實現思路
本專利技術的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種用于鑒別五靈脂的引物組。本專利技術還提供了一種用于鑒別五靈脂的試劑盒及檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采用下述技術方案：一種用于鑒別五靈脂的引物組，包括一對特異性引物，序列如下：上游引物：5'CGTGAAGAGGCGGAGATA3'，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5'AGCGGTTACACCATTTGGA3'，如SEQIDNO.2所示；一種用于鑒別五靈脂的試劑盒，包含上述引物組。上述引物組、試劑盒用于鑒別五靈脂的用途。一種用于鑒別五靈脂的檢測方法，包括步驟：（1）從待測樣品中提取DNA為模板；（2）利用上述的引物組作為PCR擴增的引物，進行PCR擴增，得到擴增產物；（3）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測對擴增產物進行鑒定。作為優選技術方案之一，步驟（2）的PCR反應體系為25μL，包括：10×緩沖液2.5μL，濃度為2.5mmol/L的dNTPs2.0μL，濃度為10μmol/L的如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物各1.0μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，待測樣本DNA模板2.0μL，重蒸水補足至25μL。作為優選技術方案之一，步驟（2）中PCR擴增條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環；72℃10min。作為優選技術方案之一，步驟（3）采用質量濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，只擴增出一條340bp左右的特異性條帶。本專利技術的有益效果：本專利技術以五靈脂的一對特異性引物對待測樣本DNA提取物進行PCR擴增，為五靈脂的檢測和鑒定提供準確的靶標位點，快速準確進行鑒定。本專利技術的檢測方法簡便，快捷，有效，能夠從干燥的五靈脂糞便中快速準確的鑒定出五靈脂。本專利技術靈敏度高，所需要的DNA用量少，與傳統的形態鑒定和常規的動物通用引物PCR檢測方法相比，具有實用性好，特異性強和準確性高的優點。本專利技術直接從待測樣品中提取DNA后直接進行PCR擴增，可在5～6個小時內完成對五靈脂的檢測，大大提高了檢測效率。總之，本專利技術可用于五靈脂真偽的快速鑒別，為中草藥五靈脂市場的健康穩定發展具有重要的意義。附圖說明圖1是使用五靈脂本專利技術的一對特異性引物鑒定8種待測樣品是否為五靈脂正品的PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；1代表以水作為模板的空白對照，2代表鼠屬偽品，3～10代表待測樣品。圖2是對所擴增序列測序峰圖。圖3是五靈脂引物特異性驗證圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；1～5代表五靈脂正品，6代表大鼠糞便，7代表小鼠糞便，8代表兔糞便，9以水作為模板的空白對照。圖4是五靈脂特異性引物靈敏度檢測圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準；1代表稀釋100倍，2代表稀釋10-1倍，3代表10-2倍，4代表稀釋10-3倍，5代表稀釋10-4倍，6代表稀釋10-5倍。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本專利技術，并不對其內容進行限定。1、本專利技術采用的主要試劑及儀器如下OMEGAStoolDNA試劑盒購自OMEGA公司，TaqDNA聚合酶、10×緩沖液、dNTPs購自寶生物（大連）生物公司。PCR擴增儀（EppendorfPCR擴增儀），測序儀（ABI3700XLDNA測序儀），離心機（德國Eppendorf5810多功能臺式離心機），凝膠成像系統（BIO-RAD）。2、樣品DNA的提取采用OMEGAStoolDNA試劑盒，具體的操作步驟參考說明書進行樣品DNA的提取。3、PCR檢測體系的建立利用提取的待測樣本作為模板，選擇線粒體16SrRNA基因作為研究對象，在Genbank中查找該基因序列，設計五靈脂的特異性引物，進行PCR擴增，檢測擴增效果。引物組序列：上游引物：5'CGTGAAGAGGCGGAGATA3'，如SEQIDNO.1所示下游引物：5'AGCGGTTACACCATTTGGA3'，如SEQIDNO.2所示PCR反應：以待測樣本為模板，進行PCR擴增，25μL反應體系中包括以下溶液或試劑：TaqDNA聚合酶0.2μL10×緩沖液2.5μLdNTPs（2.5mmol/L）2.0μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLDNA模板2.0μL重蒸水補足至25μL；經過梯度PCR摸索實驗條件，最終確定退火溫度采用55℃，PCR反應擴增程序為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環；72℃10min，16℃保存。PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小為340bp左右，五靈脂正品能很好地擴增，而偽品無擴增產物。PCR擴增產物測序：將PCR產物利用特異性引物進行正反向測序，得到的序列拼接后，與NCBI數據庫Blast比對，結果與五靈脂的16SrRNA基因序列均一致，說明該引物特異性強，可快速鑒定出五靈脂正品。對收集到的8個五靈脂樣品進行PCR檢測，以無菌水和鼠屬偽品作為陰性對照，見圖1結果顯示，五靈脂為陽性，擴增出預期340bp左右的條帶。將所擴增的產物進行測序，測序結果見圖2，序列如SEQIDNO.3所示。將擴增序列拼接進行Blast分析，結果顯示所擴增的序列與五靈脂的宿主復齒鼯鼠的相似度99%，說明本研究的方法能夠快速檢測出五靈脂。4、五靈脂引物特異性驗證：利用鼠兔的糞便與正品五靈脂進行對比，檢測五靈脂引物的特異性。結果見圖3，正品五靈脂擴增出一條340bp特異性條帶，而無菌水和其他動物的糞便均未擴增出條帶。5、五靈脂特異性引物靈敏度檢測用紫外線分光光度計檢測五靈脂基因組DNA原始濃度為44.35ng/μL，按照10倍梯度進行稀釋（100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5），檢測其特異引物的靈敏度。結果如圖4，根據本專利技術的PCR反應體系，五靈脂特異引物的檢測靈敏度達到4.43ng/μL。上述雖然結合附圖對本專利技術的具體實施方式進行了描述，但并非對本專利技術保護范圍的限制本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于鑒別五靈脂的引物組，其特征在于，包括一對特異性引物，序列如下：上游引物：5'?CGTGAAGAGGCGGAGATA?3'，如SEQ?ID?NO.1所示；下游引物：5'?AGCGGTTACACCATTTGGA?3'，如SEQ?ID?NO.2所示。

【技術特征摘要】
1.一種用于鑒別五靈脂的引物組，其特征在于，包括一對特異性引物，序列如下：上游引物：5'CGTGAAGAGGCGGAGATA3'，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5'AGCGGTTACACCATTTGGA3'，如SEQIDNO.2所示。2.一種用于鑒別五靈脂的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的引物組。3.權利要求1所述的引物組、權利要求2所述的試劑盒用于鑒別五靈脂的用途。4.一種用于鑒別五靈脂的檢測方法，其特征在于，包括步驟：（1）從待測樣品中提取DNA為模板；（2）利用上述的引物組作為PCR擴增的引物，進行PCR擴增，得到擴增產物；（3）利用瓊脂糖凝膠電泳檢測對擴增產物進行鑒定。5.根據權利要求4所述的檢...

【專利技術屬性】
技術研發人員：步迅，劉艷艷，譚晴晴，范陽陽，胡悅，張全芳，
申請(專利權)人：山東省農業科學院生物技術研究中心，
類型：發明
國別省市：山東,37