一種用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅病毒的試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅病毒的試劑盒。本發明專利技術保護引物探針組合，由引物探針組Ⅰ、引物探針組Ⅱ和引物探針組Ⅲ組成；引物探針組Ⅰ由引物ZIKV?F、引物ZIKV?R和探針ZIKV?P組成；引物探針組Ⅱ由引物DENV?F、引物DENV?R1、引物DENV?R2和探針DENV?P組成；引物探針組Ⅲ由引物CHIKV?F、引物CHIKV?R和探針CHIKV?P組成；引物ZIKV?F、引物ZIKV?R、探針ZIKV?P、引物DENV?F、引物DENV?R1、引物DENV?R2、探針DENV?P、引物CHIKV?F、引物CHIKV?R、探針CHIKV?P依次如序列1至10所示。本發明專利技術對于寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅熱病毒的檢測和相關疾病的防控具有重大價值。

【技術實現步驟摘要】
一種用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅病毒的試劑盒
本專利技術涉及一種用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅病毒的試劑盒。
技術介紹
蚊媒病毒在全世界分布廣泛，是一種重要的傳染病病原，主要通過蚊蟲叮咬傳播，傳播速度快，易對人類和社會造成嚴重危害，特別是近年來，不斷爆發蚊媒病毒疫情。蚊媒病毒大多屬于黃熱病毒科黃熱病毒屬，主要有黃熱病毒、登革熱病毒以及寨卡病毒，還有少數為膜病毒科甲病毒屬，例如基孔肯雅病毒，這些病毒都屬于蚊媒傳播病毒，且近年來，不斷有疫情爆發。2015年-2016年在巴西爆發寨卡病毒疫情，迅速蔓延至30多個國家和地區，同時在歐洲、北美等地的多個國家均報告發現輸入性病例，我國今年也報告了多例輸入性病例，由于寨卡病毒可能導致胎兒小頭畸形、引起格林-巴利綜合征而受到廣泛關注。近年來，引起過大規模傳染病爆發的蚊媒病毒還有登革熱病毒和基孔肯雅病毒，世界衛生組織每年都收到大約50萬份登革熱病例的報告。目前，我國已有研究機構研制出基于實時熒光定量PCR探針法的寨卡病毒檢測方法、登革熱病毒檢測方法和基孔肯雅病毒檢測方法，但這些方法均為單指標的病毒檢測方法。如果需要同時篩查相關的蚊媒病毒，需要用到多種試劑盒，樣品消耗量大，操作復雜，成本高昂。目前基于實時熒光定量PCR探針法的核酸檢測試劑，由于試劑中的DNA聚合酶和逆轉錄酶必須保存于-20℃條件下，因此，這類核酸檢測試劑均需使用干冰，以保證冷鏈運輸和低溫儲存，保證試劑盒不失效。但由于蚊媒相關病毒，如寨卡病毒、登革熱病毒、基孔肯雅病毒等的多發地集中于非洲、南美和東南亞等熱帶地區，受當地氣候條件及經濟狀況的限制，絕大多數地方要實現試劑的冷鏈運輸非常困難，使得這些核酸檢測試劑在這些地區的應用受到很大的限制。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒和基孔肯雅病毒的試劑盒。本專利技術首先保護引物探針組合(引物探針組合甲)，由引物探針組Ⅰ、引物探針組Ⅱ和引物探針組Ⅲ組成；所述引物探針組Ⅰ由引物ZIKV-F、引物ZIKV-R和探針ZIKV-P組成；所述引物ZIKV-F為如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ZIKV-R為如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述探針ZIKV-P的核苷酸序列為如下(b5)或(b6)；(b5)如序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅱ由引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2和探針DENV-P組成；所述引物DENV-F為如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV-R1為如下(c3)或(c4)；(c3)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV-R2為如下(c5)或(c6)；(c5)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子；所述探針DENV-P的核苷酸序列為如下(c7)或(c8)；(c7)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅲ由引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探針CHIKV-P組成；所述引物CHIKV-F為如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述引物CHIKV-R為如下(d3)或(d4)；(d3)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(d4)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述探針CHIKV-P的核苷酸序列為如下(d5)或(d6)；(d5)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(d6)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子。所述探針ZIKV-P的末端標記有熒光基團甲，所述探針DENV-P的末端標記有熒光基團乙，所述探針CHIKV-P的末端標記有熒光基團丙。所述熒光基團甲、所述熒光基團乙和所述熒光基團丙為不同的熒光基團。具體來說，探針ZIKV-P的5'末端具有熒光基團JOE，3’末端具有淬滅基團BHQ2。具體來說，探針DENV-P的5'末端具有熒光基團FAM，3’末端具有淬滅基團BHQ1。具體來說，探針CHIKV-P的5'末端具有熒光基團CY5，3’末端具有淬滅基團BHQ3。所述引物探針組合甲的用途為如下(e1)或(e2)：(e1)鑒定寨卡病毒和/或登革熱病毒和/或基孔肯雅病毒；(e2)檢測待測樣本中是否含有寨卡病毒和/或登革熱病毒和/或基孔肯雅病毒。本專利技術還保護一種試劑盒(試劑盒甲)，包括所述引物探針組合甲。具體來說，所述試劑盒甲包括反應管C；所述反應管C中包埋有所述引物ZIKV-F、所述引物ZIKV-R、所述探針ZIKV-P、所述引物DENV-F、所述引物DENV-R1、所述引物DENV-R2、所述探針DENV-P、所述引物CHIKV-F、所述引物CHIKV-R和所述探針CHIKV-P。所述引物和探針具體借助封裝試劑包埋于反應管。所述封裝試劑由3-10質量份瓊脂糖、1-5質量份皂苷和2-6質量份羥丙基纖維素組成。所述封裝試劑具體由5質量份瓊脂糖、3質量份皂苷和4質量份羥丙基纖維素鈉組成。反應管具體可為取八連排的PCR反應管。所述反應管C的制備方法具體如下：①將封裝試劑、引物ZIKV-F、引物ZIKV-R、探針ZIKV-P、引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2、探針DENV-P、引物CHIKV-F、引物CHIKV-R、探針CHIKV-P和無菌水混合，得到包埋液(包埋液中，封裝試劑的濃度為0.1g/100ml，引物ZIKV-F的濃度為2μM、引物ZIKV-R的濃度為2μM、探針ZIKV-P的濃度為1μM、引物DENV-F的濃度為2μM、引物DENV-R1的濃度為2μM、引物DENV-R2的濃度為2μM、探針DENV-P的濃度為1μM、引物CHIKV-F的濃度為2μM、引物CHIKV-R的濃度為2μM、探針CHIKV-P的濃度為1μM)；②向每個反應管內滴加2μl包埋液，然后冷凍干燥。所述試劑盒甲還包括反應組分A和/或反應組分B。所述反應組分A(無色透明的液體)：由溶質和溶劑組成；溶劑為pH8.0-8.4、50mM的Tris-HCl緩沖液；溶質及其在反應組分A中的濃度如下：KCl40-100mM、MgCl21.5-4mM、dNT本文檔來自技高網...

【技術保護點】
引物探針組合，由引物探針組Ⅰ、引物探針組Ⅱ和引物探針組Ⅲ組成；所述引物探針組Ⅰ由引物ZIKV?F、引物ZIKV?R和探針ZIKV?P組成；所述引物ZIKV?F為如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ZIKV?R為如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述探針ZIKV?P的核苷酸序列為如下(b5)或(b6)；(b5)如序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅱ由引物DENV?F、引物DENV?R1、引物DENV?R2和探針DENV?P組成；所述引物DENV?F為如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV?R1為如下(c3)或(c4)；(c3)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV?R2為如下(c5)或(c6)；(c5)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子；所述探針DENV?P的核苷酸序列為如下(c7)或(c8)；(c7)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅲ由引物CHIKV?F、引物CHIKV?R和探針CHIKV?P組成；所述引物CHIKV?F為如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述引物CHIKV?R為如下(d3)或(d4)；(d3)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(d4)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述探針CHIKV?P的核苷酸序列為如下(d5)或(d6)；(d5)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(d6)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子。...

【技術特征摘要】
1.引物探針組合，由引物探針組Ⅰ、引物探針組Ⅱ和引物探針組Ⅲ組成；所述引物探針組Ⅰ由引物ZIKV-F、引物ZIKV-R和探針ZIKV-P組成；所述引物ZIKV-F為如下(b1)或(b2)；(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；(b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ZIKV-R為如下(b3)或(b4)；(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；(b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；所述探針ZIKV-P的核苷酸序列為如下(b5)或(b6)；(b5)如序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；(b6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅱ由引物DENV-F、引物DENV-R1、引物DENV-R2和探針DENV-P組成；所述引物DENV-F為如下(c1)或(c2)；(c1)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；(c2)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV-R1為如下(c3)或(c4)；(c3)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；(c4)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物DENV-R2為如下(c5)或(c6)；(c5)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；(c6)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子；所述探針DENV-P的核苷酸序列為如下(c7)或(c8)；(c7)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；(c8)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；所述引物探針組Ⅲ由引物CHIKV-F、引物CHIKV-R和探針CHIKV-P組成；所述引物CHIKV-F為如下(d1)或(d2)；(d1)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；(d2)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；所述引物CHIKV-R為如下(d3)或(d4)；(d3)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；(d4)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；所述探針CHIKV-P的核苷酸序列為如下(d5)或(d6)；(d5)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；(d6)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子。2.如權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于：所述探針ZIKV-P的末端標記有熒光基團甲，所述探針DENV-P的末端標記有熒光基團乙，所述探針CHIKV-P的末端標記有熒光基團丙；所述熒光基團甲、所述熒光基團乙和所述熒光基團丙為不同的熒光基團。3.一種試劑盒，包括權利要求1或2所述引物探針組合。4.一種試劑盒，包括反應管C；所述反應管C包埋有權利要求2中的所述引物ZIKV-F、所述引物ZIKV-R、所述探針ZIKV-P、所述引物DENV-F、所述引物DENV-R1、所述引物DENV-R2、所述探針DENV-P、所述引物CHIKV-F、所述引物CHIKV-R和所述探針CHIKV-P。5.如權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括反應組分A和/或反應組分B；所述反應組分A：由溶質和溶劑組成；溶劑為pH8.0-8.4、50mM的Tris-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張巖，蓋偉，單萬水，邢婉麗，宋翠丹，馬桂紅，劉厚明，程京，
申請(專利權)人：博奧生物集團有限公司，深圳市第三人民醫院，
類型：發明
國別省市：北京,11