一種高靈敏度的OsHV?1實時熒光定量PCR檢測試劑盒及方法技術

本發明專利技術提供了一種用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV?1的試劑盒和方法。所述的試劑盒包括一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV?1的引物組和熒光探針；所述的引物組由四條引物組成，用于巢氏擴增牡蠣皰疹病毒OsHV?1的特定DNA片段。本發明專利技術提供的檢測方法使得四條引物和一條熒光探針在一管中通過一步擴增即可完成巢氏擴增和實時熒光定量PCR，用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV?1。本發明專利技術提供了一種兼具高靈敏度、特異性、準確性的OsHV?1實時熒光定量PCR檢測方法及試劑盒，能夠實現對牡蠣及養殖牡蠣的水體進行快速檢測，應用極為方便，基于上述優點，該試劑盒適合在水產養殖單位和水產養殖品監管部門等進行推廣應用，具有廣泛的應用前景。

【技術實現步驟摘要】
一種高靈敏度的OsHV-1實時熒光定量PCR檢測試劑盒及方法
本專利技術屬于生物檢測
，涉及一種牡蠣皰疹病毒OsHV-1的檢測，具體涉及一種OsHV-1實時熒光定量PCR檢測試劑盒及方法。
技術介紹
牡蠣是世界重要養殖貝類，在我國和世界上很多沿海地區廣泛分布。牡蠣養殖產量居海產動物首位，具有很高的經濟價值。但牡蠣經常爆發大規模死亡，嚴重制約著牡蠣養殖業的發展，造成嚴重經濟損失。1972年在美洲牡蠣中首先發現了牡蠣皰疹病毒OsHV-1。目前OsHV-1已被證明與牡蠣的大規模死亡有關。為了降低牡蠣皰疹病毒OsHV-1造成的經濟損失，往往需要對養殖水體及牡蠣進行檢測。目前為了獲得相對較高的特異性，對牡蠣皰疹病毒OsHV-1的檢測方法通常采用巢氏PCR的方式。例如，中國專利申請201510623544公開了一種牡蠣皰疹病毒I型檢測引物和方法，它包括外引物PFor1、PRev1和內引物PFor2、PRev2。該方法利用巢氏PCR技術，采用兩對PCR引物，通過兩輪PCR反應擴增，最后對擴增產物進行電泳，根據電泳擴增條帶情況判斷樣本是否感染牡蠣皰疹病毒OsHV-1。再例如，中國專利申請201610052695公開了一種牡蠣皰疹病毒不同變異株的巢式PCR檢測方法。該檢測方法以牡蠣皰疹病毒DNA聚合酶基因功能結構域核苷酸序列為模板，設計兩對嵌套式引物，并以此為主題設計巢式PCR檢測方法。同樣，該方法也是通過兩輪PCR反應擴增，最后對擴增產物進行電泳，根據電泳擴增條帶情況判斷樣本是否感染牡蠣皰疹病毒。利用巢氏PCR技術對牡蠣皰疹病毒OsHV-1進行檢測，雖然具有相對較高的特異性，然而上述方法都具有一個嚴重的缺陷，即需要通過兩輪PCR擴增，也就是需要開管取產物才能進行第二輪擴增，并且都需要進行配制瓊脂糖凝膠電泳。正是由于巢氏PCR具有較高特異性，因此極易受到污染產生假陽性結果，開管進行兩輪PCR反應、配制瓊脂糖凝膠等步驟又大大增加了待檢測樣品收到污染的可能性。另外，上述方法需要使用到具有嚴重毒性的DNA燃料，并不利于環保。因此，盡管巢氏PCR技術具有較高的特異性，然而其極易受到污染并產生假陽性結果。也有將環介導等溫擴增技術用于牡蠣皰疹病毒OsHV-1的檢測方法。例如中國專利申請201610231091公開了鑒定或輔助鑒定牡蠣皰疹病毒的引物組合物，并通過環介導等溫擴增技術對OsHV-1進行檢測。然而環介導等溫擴增技術是鏈置換合成，擴增的靶序列長度相對較短，通常在260bp左右，當序列長度大于400bp則較難擴增，因此其使用的范圍相對較窄；更重要的是，由于環介導等溫擴增的靈敏度相對較高，也因此極易受到污染而產生的假陽性結果；另外，其在產物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統的PCR方法。環介導等溫技術由于其適用范圍窄，極易受污染出現假陽性，即準確性和可重復性較差，后續操作不便等諸多缺陷，因此在實際使用中并不適用于OsHV-1的檢測工作。除了上述兩種方法，還有使用實時熒光定量PCR技術對牡蠣皰疹病毒OsHV-1進行檢測。例如中國專利申請201610236196公開了鑒定或輔助鑒定牡蠣皰疹病毒的試劑盒及其專用引物，其利用TaqMan實現對OsHV-1進行檢測。該方法雖然具有相對較高的靈敏度，然而其特異性確遠不如巢氏PCR技術。綜上所述，開發出一種靈敏度、準確性、特異性、可重復性均相對更高，且操作便捷的OsHV-1檢測方法、試劑、或試劑盒是牡蠣養殖業中亟待解決的技術問題。
技術實現思路
如無特殊說明，本專利技術中的：術語“RNasefreeH2O”指不含RNA酶以及任何DNA的純水或超純水。本專利技術要解決的技術問題是提供一種用于牡蠣皰疹病毒OsHV-1檢測的試劑盒及方法，使其靈敏度、準確性、特異性、可重復性均相對更高，且操作便捷。一個方面，本專利技術提供了一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的引物組。本專利技術所述的一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的引物組由引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2組成；本專利技術所述的引物OsHV-F1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：5’-TGGTGGCGTTCCACAACTTGGCA-3’：本專利技術所述的引物OsHV-R1的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：5’-GAGAGCAGACCAAATGCATCGCCA-3’：本專利技術所述的引物OsHV-F2的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示：5’-TGTGATGTAGACAAGGCATATAAATTGA-3’：本專利技術所述的引物OsHV-R2的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示：5’-AATGCATCGCCATTGAAAATTA-3’：另一個方面，本專利技術提供了一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的熒光探針OsHV-P，所述的熒光探針OsHV-P為TaqMan探針，所述的熒光探針OsHV-P的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示：5’-ATGTGCATCCCTGCCGTAGCTCTC-3’：所述的熒光探針OsHV-P的核苷酸序列的5’端連接熒光基團FAM，3’端連接猝滅基團BHQ1。另一個方面，本專利技術提供了一種用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的試劑盒，所述的試劑盒包括本專利技術所述的引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2。所述的試劑盒還包括本專利技術所述的一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的熒光探針OsHV-P。所述的試劑盒還可以包括病毒DNA提取試劑、DNA聚合酶、陽性質控品和陰性質控品。所述的陽性質控品為：以牡蠣皰疹病毒OsHV-1的基因組DNA為PCR模板，以本專利技術所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1為PCR引物擴增得到的DNA片段，或含有該DNA片段的核酸片段或質粒。所述的陰性質控品為RNasefreeH2O。本專利技術所述的一種用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的試劑盒中的引物組包含四條引物，用于對OsHV-1中特定區域的擴增，四條引物同時擴增使得擴增反應特異性大大提高；本專利技術采用實時熒光定量PCR技術使得OsHV-1的檢測的靈敏度也相對更高。再一個方面，本專利技術提供了一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的方法，所述的方法指利用本專利技術所述的檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的引物組和熒光探針，使用實時熒光定量PCR技術檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1；所述的檢測方法包括以下步驟：(1)從待測樣本中提取病毒DNA；(2)制備陽性質控品：以牡蠣皰疹病毒OsHV-1的基因組DNA為PCR模板，以本專利技術所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1為PCR引物，PCR擴增得到的DNA片段，或含有該DNA片段的核酸片段或質粒為陽性質控品；(3)實時熒光定量PCR：以步驟(1)提取的病毒DNA為模板，利用本專利技術所述的一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的引物組和熒光探針OsHV-P，通過以下PCR擴增程序進行實時熒光定量PCR：PCR擴增程序：94～96℃預變性2分鐘；94～95℃變性15～30秒、65～69℃退火30～75秒、68～72℃延伸30～40秒，6～9個循環；93～95℃變性15～20秒、60℃退火30秒、68～72℃延伸30秒，8個循環；93～95℃變性15秒、52～55℃退火延伸30～60秒，40個循環；55本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV?1的引物組，其特征在于：所述的引物組由引物OsHV?F1、引物OsHV?R1、引物OsHV?F2和引物OsHV?R2組成；所述的引物OsHV?F1的序列為SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV?R1的序列為SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV?F2的序列為SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV?R2的序列為SEQ?ID?NO：4所示的核苷酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的引物組，其特征在于：所述的引物組由引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2組成；所述的引物OsHV-F1的序列為SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV-R1的序列為SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV-F2的序列為SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；所述的引物OsHV-R2的序列為SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。2.一種用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的熒光探針OsHV-P，其特征在：所述的熒光探針OsHV-P為TaqMan探針，所述的熒光探針OsHV-P的序列為SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；所述的熒光探針OsHV-P的核苷酸序列的5’端連接熒光基團FAM，3’端連接猝滅基團BHQ1。3.一種用于檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包括權利要求1所述的引物組和權利要求2所述的熒光探針OsHV-P。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括病毒DNA提取試劑、DNA聚合酶、陽性質控品和陰性質控品。5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述的陽性質控品為：以牡蠣皰疹病毒OsHV-1的基因組DNA為PCR模板，以權利要求1所述的引物OsHV-F1和OsHV-R1為PCR引物擴增得到的DNA片段，或含有該DNA片段的核酸片段或質粒；所述的陰性質控品為RNasefreeH2O。6.一種利用權利要求3-5任意一項所述的試劑盒檢測牡蠣皰疹病毒OsHV-1的方法，其特征在于：所述的檢測方法指利用該試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于：所述的方法包括以下步驟：(1)從待測樣本中提取病毒DNA；(2)制備陽性質控品：以牡蠣皰疹病毒OsHV-1的基因組DNA為PCR模板，以引物OsHV-F1和OsHV-R1為PCR引物，PCR擴增得到的DNA片段，或含有該DNA片段的核酸片段或質粒為陽性質控品...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉貴明，疏義林，王緒敏，
申請(專利權)人：中國科學院北京基因組研究所，
類型：發明
國別省市：北京,11