區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物，利用經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒特征性核苷酸序列存在GC含量差異來設(shè)計。利用本組引物對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)均可有效擴增，但可在經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線存在熔解溫度（Tm值）差異來對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行有效區(qū)分。配合實時熒光定量PCR儀連接的電腦并利用儀器自帶的分析軟件，可達到僅需一組引物，即可特異性地對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染情況進行鑒別診斷。本發(fā)明專利技術(shù)鑒定方法簡單，效率和準(zhǔn)確率較高。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物
本專利技術(shù)屬于動物傳染病學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒實時的熒光定量PCR引物。
技術(shù)介紹
鴨肝炎是由鴨肝炎病毒引起的、侵害雛鴨的一種高度致死性傳染病，臨床以急性肝炎為特征，主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨，尤其以1周齡內(nèi)的雛鴨為甚，病死率可達100%。目前，隨著我國鴨飼養(yǎng)密度的加大、患病鴨和病死鴨處置的不規(guī)范、各種貿(mào)易活動的日益頻繁以及免疫抑制病的出現(xiàn)等諸多原因，鴨肝炎的危害日趨嚴(yán)重，已成為養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。在我國，鴨群中流行的鴨肝炎病毒主要以經(jīng)典型鴨肝炎病毒為主，但關(guān)于韓國型鴨肝炎病毒感染的報道也日益增多。然而無論是經(jīng)典型鴨肝炎病毒，還是韓國型鴨肝炎病毒，均主要侵害3周齡內(nèi)的雛鴨，病死鴨多呈角弓反張，剖檢可見肝臟腫大、出血，無法從臨床剖檢對二者進行有效鑒別診斷。本專利技術(shù)的一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物，僅需1組引物對（2條引物）即可對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行有效區(qū)分。該引物根據(jù)經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒存在特征性核苷酸序列差異來設(shè)計，利用實時熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線的Tm值和其GC含量正相關(guān)的特點，通過觀察經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒經(jīng)該組引物進行實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)后的熔解曲線Tm值差異，即可精確對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染情況進行準(zhǔn)確鑒別診斷，相關(guān)研究尚未見國內(nèi)外文獻報道，本專利技術(shù)可填補相關(guān)領(lǐng)域空白。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物及其應(yīng)用，該引物能有效區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染（或共感染），為科學(xué)防控鴨肝炎病毒感染提供技術(shù)保障。本專利技術(shù)根據(jù)經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒存在特征性的核苷酸序列差異來設(shè)計一組實時熒光定量PCR引物。該引物針對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行PCR擴增均可得到特異性目的條帶，利用該擴增區(qū)域經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒存在核苷酸GC含量差異，通過建立基于EvaGreen的實時熒光定量PCR方法對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)，獲得的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）差異，根據(jù)熔解曲線Tm值差異可直接對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染情況進行鑒別診斷。為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物，其核苷酸序列為：上游引物F1:5′-AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，下游引物R1:5′-GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。通過所述引物建立基于EvaGreen的實時熒光定量PCR方法，根據(jù)該引物擴增的經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒所存在的核苷酸特征性差異——GC含量的差異，可導(dǎo)致實時熒光定量PCR反應(yīng)擴增反應(yīng)后生成的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值），可直接對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染進行鑒別。具體包括以下步驟：1、設(shè)計并合成上述特異性引物對F1/R1；2、病毒RNA提取：從檢測樣品中分別提取經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的RNA；3、RT-PCR擴增：利用鴨肝炎特異性引物對DHVF/DHVR對提取的核酸RNA反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，將PCR擴增的目的片段進行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的陽性重組質(zhì)粒，測定其OD值計算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。所用鴨肝炎特異性引物對DHVF/DHVR的核苷酸序列為：DHVF:5’-GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGTA-3’；DHVR:5’-ACTCGACCAGCCGCGACC-3’。4、實時熒光定量PCR：用所述實時熒光定量引物F1和R1對含有經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的陽性重組質(zhì)粒進行EvaGreen實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)完成后獲得相應(yīng)的擴增曲線，并生成EvaGreen實時熒光定量PCR擴增的熔解曲線。5、病毒感染情況判斷：實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察擴增曲線判斷是否存在經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染；通過觀察熔解曲線其Tm值差異可對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行鑒別。其中，設(shè)計的實時熒光定量PCR引物需滿足如下要求：（1）特異性強：該實時熒光定量PCR產(chǎn)物需選擇經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒核苷酸序列進行分析后保守的區(qū)域設(shè)計，以便僅需一組引物能對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行擴增，即觀察實時熒光定量PCR反應(yīng)后的擴增曲線便可對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染進行判斷。（2）兩種病毒的擴增區(qū)域GC含量不同：該組引物對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的擴增區(qū)域的核苷酸序列存在GC含量差異。基于實時熒光定量PCR反應(yīng)生成的熔解曲線的Tm峰值差異（該差異和核苷酸序列的GC含量差異正相關(guān)），即可通過觀察實時熒光定量PCR反應(yīng)后的熔解曲線對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染進行判斷（可有效區(qū)分是經(jīng)典型鴨肝炎病毒還是韓國型鴨肝炎病毒）。其中，所述的步驟（5）的病毒感染情況判斷方法如下：若在Tm=（87.2±0.20）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為經(jīng)典型鴨肝炎病毒陽性；若在Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為韓國型鴨肝炎病毒陽性；若在Tm=（87.2±0.20）℃以及Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒雙重感染；其他情況均判為陰性。本專利技術(shù)所設(shè)計的實時熒光定量PCR引物對F1/R1可用于制備區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒感染的試劑盒。本專利技術(shù)的有益效果：鑒定方法簡單，效率和準(zhǔn)確率較高。使用本研究提供的一組實時熒光定量PCR引物對前期分離的5株經(jīng)典型鴨肝炎病毒和3株韓國型鴨肝炎病毒進行實時熒光定量PCR檢測，均和預(yù)期相符。且僅需1組引物對（2條引物）即可有效對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行有效區(qū)分。附圖說明圖1鴨肝炎病毒定量PCR引物設(shè)計區(qū)；圖2鴨肝炎病毒基因擴增區(qū)域的核苷酸差異；圖3特異性引物對F1/R1對經(jīng)典型鴨肝炎病毒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖4特異性引物對F1/R1對韓國型鴨肝炎病毒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；圖5特異性引物對F1/R1對經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本專利技術(shù)做進一步的描述。實施例11、毒株：經(jīng)典型鴨肝炎病毒（JX1132株）和韓國型鴨肝炎病毒（FJ1521株）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。2、引物設(shè)計與合成根據(jù)經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的核苷酸特征性差異區(qū)設(shè)計實時熒光定量PCR反應(yīng)的引物F1和R1，引物序列為：上游引物F1：5′-AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，下游引物R1:5′-GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。3、病毒RNA提取以及RT-PCR擴增：以常規(guī)方法提取經(jīng)典型鴨肝炎病毒（JX1132株）和韓國型鴨肝炎病毒（FJ1521株）的病毒RNA。利用鴨肝炎特異性引物對DHVF/DHVR對提取的核酸RNA進行PCR擴增，將PCR擴增的目的片段進行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的陽性重組質(zhì)粒，測定其OD值計算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實時熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。所用鴨肝炎特異性引物對DHVF/DH本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物核苷酸序列為：上游引物F1:?5′??AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC?3′，下游引物R1:?5′??GACCAGCCGCGACCCTAT?3′。

【技術(shù)特征摘要】
1.一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國型鴨肝炎病毒的實時熒光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物核苷酸序列為：上游引物F1:5′-AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，下游引...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳珍，萬春和，施少華，陳翠騰，朱春華，蔡國漳，劉斌瓊，黃瑜，
申請(專利權(quán))人：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：福建,35