本發明專利技術提供了一組區分clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV的實時熒光定量PCR引物，利用clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV血凝素基因（HA）特征性核苷酸序列存在GC含量差異來設計。利用本組引物對clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV進行實時熒光定量PCR反應均可有效擴增，但其在clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV的實時熒光定量PCR反應后生成的熔解曲線存在熔解溫度（Tm值）差異來對clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV進行有效區分。配合和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦并利用儀器自帶的分析軟件，可達到僅需一組引物，即可特異性的對clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV感染情況進行鑒別診斷。本發明專利技術鑒定方法簡單，效率和準確率較高。
【技術實現步驟摘要】
區分clade2．3．2．1和clade2．3．4．4H5AIV的實時熒光定量PCR引物
本專利技術屬于動物傳染病學領域，具體涉及一組區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的實時熒光定量PCR引物。
技術介紹
禽流感（Avianinfluneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鳥的一種急性、高度接觸性傳染病。高致病性H5亞型禽流感病毒（H5subtypeavianinfluenzavirus,H5AIV）引起的感染目前被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，在我國被列為一類動物疫病。關于流感的最早記錄可追溯到1878年來自意大利的一次報道，隨后世界各地陸續發生流感的暴發和流行。1996年，在我國分離到的第一株H5N1亞型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），緊接著香港于1997年發生H5N1亞型禽流感病毒直接感染人事件，這是第一個禽源流感病毒未經中間宿主而直接感染人的證據。由于從祖源病毒GS/GD/96進化出多個譜系且命名不統一，為此WHO、FAO和OIE聯合制定了H5N1HPAIV統一分類準則將H5N1HPAIV分為0~9共計10個不同clade。其中clade2.3.4最早于2003~2006年間流行于中國、越南、泰國、老撾和馬來西亞等地的病毒株，2006~2009年clade2.3.4分支在我國很多地區是優勢流行株；而2010年后逐漸被clade2.3.2.1分支取代，以A/duck/Guangdong/S1322/2006為HA和NA基因供體研制Re-6株疫苗來控制clade2.3.2.1分支病毒的流行。近年來，出現了clade2.3.4.4分支病毒，針對該類病毒研制了Re-8株疫苗。對clade2.3.4和clade2.3.2.1H5AIV進行鑒別診斷有助于指導H5AIV相應疫苗的科學使用。然而，clade2.3.2.1和clade2.3.4二者之間的基因序列核苷酸同源率大于94.3%（以經典毒株的同源率為例），很難通過常規的分子生物學方法（如常規RT-PCR方法）進行鑒別。本專利技術的一組區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的實時熒光定量PCR引物僅需1組引物對（2條引物）即可有效對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV進行有效區分。該引物根據clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差異來設計；利用實時熒光定量PCR反應后生成的熔解曲線的Tm值和其GC含量正相關的特點，通過觀察clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV經該組引物進行實時熒光定量PCR擴增反應后的熔解曲線Tm值差異，即可精確對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV感染情況進行準確鑒別診斷，相關研究尚未見國內外文獻報道，本專利技術可填補相關領域空白。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一組區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的實時熒光定量PCR引物及其應用，該引物能有效區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV感染（或共感染），為科學防控H5AIV提供技術保證。本專利技術根據clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因（HA）存在特征性的核苷酸序列差異來設計一組實時熒光定量PCR引物。利用該擴增區域clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因（HA）存在的核苷酸GC含量差異，通過建立基于EvaGreen實時熒光定量PCR方法對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因（HA）進行實時熒光定量PCR擴增反應，獲得的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）差異，根據熔解曲線Tm值差異可直接對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV感染情況進行鑒別診斷。為實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：一組區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的實時熒光定量PCR引物，其核苷酸序列為：上游引物F1：5’-ATTGACAAAATGAACACTC-3’；下游引物R1：5’-CCAGACATCTAGGAATCCGT-3’。通過所述引物建立基于EvaGreen的實時熒光定量PCR方法，根據利用該引物擴增的clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因（HA）所存在的核苷酸特征性差異——GC含量差異，可導致實時熒光定量PCR反應擴增反應后的生成的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）的特點，可直接對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV感染進行鑒別。具體包括以下步驟：（1）設計并合成上述特異性引物對F1/R1；（2）病毒RNA提取：從檢測樣品中分別提取clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的病毒RNA；（3）RT-PCR擴增：設計并合成H5AIV血凝素基因HA特異性引物對H5-HAF/H5-HAR對提取的病毒RNA進行RT-PCR擴增，獲得其HA基因序列；將RT-PCR擴增的目的片段進行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的血凝素基因HA的陽性重組質粒（T-clade2.3.2.1-1和T-clade2.3.4.4-1），測定其OD值計算出拷貝數后，連續倍比稀釋，作為實時熒光定量PCR反應的標準品。所用H5AIV血凝素基因HA特異性引物對H5-HAF/H5-HAR的核苷酸序列為：H5-HAF:5’-TGGTTACCATGCAAACAAC-3’；H5-HAR:5’-TTACACTTTCCATACATTCATTATC-3’。（4）實時熒光定量PCR：用所述實時熒光定量引物對F1/R1對陽性重組質粒（T-clade2.3.2.1-1和T-clade2.3.4.4-1）進行EvaGreen實時熒光定量PCR擴增，反應完成后獲得相應的擴增曲線，并生成EvaGreen實時熒光定量PCR擴增的熔解曲線。（5）病毒感染情況判斷：實時熒光定量PCR反應結束后，通過觀察擴增曲線判斷是否存在clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV感染；通過觀察熔解曲線其Tm值差異可對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV進行鑒別。其中，本專利技術所設計的實時熒光定量PCR引物對F1/R1滿足如下要求：（1）特異性強：該實時熒光定量PCR引物在針對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV血凝素基因HA核苷酸序列進行分析后保守的區域設計，對二者均具有高特異性，達到僅需一組引物便能對clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV進行擴增的目的，即觀察實時熒光定量PCR反應后的擴增曲線即可判斷是否感染clade2.3.2.1或clade2.3.4.4H5AIV感染進行判斷（但無法區分是clade2.3.4H5AIV還是clade2.3.2.1H5AIV）。（2）兩種病毒的擴增區域G本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一組區分clade?2.3.2.1和clade?2.3.4.4?H5?AIV的實時熒光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物序列為：上游引物F1：5’??ATTGACAAAATGAACACTC??3’；下游引物R1：5’??CCAGACATCTAGGAATCCGT??3’。
【技術特征摘要】
1.一組區分clade2.3.2.1和clade2.3.4.4H5AIV的實時熒光定量PCR引物，其特征在于：所述PCR引物序列為：上游引物F1：5’-ATTGACAAAATGAACACTC-3’；下游引物R1：5’-CCAGACA...
【專利技術屬性】
技術研發人員：施少華，萬春和，陳珍，黃瑜，程龍飛，傅光華，陳紅梅，傅秋玲，劉榮昌，陳翠騰，
申請(專利權)人：福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：福建,35
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