K亞群禽白血病病毒熒光定量RT?PCR檢測引物組及試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種K亞群禽白血病病毒熒光定量RT?PCR檢測引物組及試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)所采用的引物對(duì)和探針是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列的gp85區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)的。其能夠特異性的擴(kuò)增出ALV?K，種內(nèi)和種間的特異性均非常好；最低能夠檢測到8.4×10?copies/μL的病毒，靈敏度是普通PCR的100倍；批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于5%，證明此方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)穩(wěn)定性好，擴(kuò)增效率高，可以用于臨床ALV?K的檢測。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測引物組及試劑盒
本專利技術(shù)屬于分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測引物組及試劑盒。
技術(shù)介紹
禽白血病病毒(Avianleukosisviruses,ALVs)是反轉(zhuǎn)錄病毒科、腫瘤病毒亞科的一員，該病毒群引起的所有良性和惡性腫瘤統(tǒng)稱為禽白血病(avianleukosis,AL)。(殷震，1997)。禽白血病被列為2012-2020年國家優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一(高鴻賓，2012)。禽白血病病毒誘發(fā)的腫瘤主要包括白血病、結(jié)締組織腫瘤、上皮性腫瘤、內(nèi)皮性腫瘤及其他相關(guān)腫瘤，其中白血病又可分為淋巴細(xì)胞性白血病(LymphoidLeucosis,LL)、成紅細(xì)胞性白血病(Erythroblastosis,EB)、成髓細(xì)胞性白血病(Myeloblastosis,MB)和髓細(xì)胞性白血病(Myelocytomatosis,ML)(Purchaseetal.,1984；霍夫斯塔，1980)。目前，病毒分離鑒定是檢測禽白血病病毒最常規(guī)基礎(chǔ)的方法，主要是測定病毒或病毒抗原，準(zhǔn)確性較高、易操作。其缺點(diǎn)在于耗時(shí)長，從采樣到檢出結(jié)果至少需要10天時(shí)間；存在假陽性或病毒隱性未檢出的可能性；花費(fèi)高；操作流程繁瑣。因此，該方法不適用于大范圍、多樣品的檢測，難以在臨床中推廣和應(yīng)用。病毒中和試驗(yàn)是檢測禽白血病病毒最靈敏的方法之一。但存在操作步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，花費(fèi)高等缺點(diǎn)，臨床實(shí)際檢測中很少用到。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是哈爾濱獸研所在20世紀(jì)80年代建立的方法。該方法需要拔羽取髓，會(huì)引起雞群較大的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)特異性也較低，會(huì)受內(nèi)源性病毒的干擾，出現(xiàn)一定的假陽性。(關(guān)云濤等，2002)。IFA的基本原理是根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)，將熒光色素標(biāo)記在已知抗體(或抗原)上，當(dāng)其與對(duì)應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，就能夠在熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光信號(hào)。IFA的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，反應(yīng)速度快，結(jié)果易觀察，但是，操作步驟繁瑣，專業(yè)要求高，耗時(shí)長，敏感度低，會(huì)因非特異染色而出現(xiàn)假陽性，在臨床上推廣范圍較窄。近幾年來，禽白血病發(fā)生頻繁，給我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來很大沖擊。經(jīng)典外源性的禽白血病病毒亞群ALV-A、ALV-B、ALV-J在檢測、凈化等方面已經(jīng)相對(duì)成熟，而對(duì)于在2008年才發(fā)現(xiàn)命名的ALV-K亞群，在相關(guān)方面的研究非常滯后。因此，建立一種快速有效的針對(duì)ALV-K的檢測方法就顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單快速的K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測方法及試劑盒。本專利技術(shù)所采取的技術(shù)方案是：一種用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物對(duì)及探針，其是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。作為優(yōu)選的，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列的gp85區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)的。所述引物對(duì)和探針的核苷酸序列如下所示：ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’(SEQIDNO.1)，ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’(SEQIDNO.2)，ALV-Pb：5’-CCATGTTAGCACCCAACCACACAGAA-3’(SEQIDNO.3)。一種用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的試劑盒，其含有如上所述的用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物對(duì)及探針。一種用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的方法，包括如下步驟：(1)提取樣品中病毒RNA；(2)利用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的引物對(duì)和探針對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(3)收集熒光信號(hào)，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到病毒拷貝數(shù)。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：42℃5min，95℃0.1min，95℃0.05min，60℃0.34min，共40個(gè)循環(huán)。本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)設(shè)計(jì)的引物和探針，能夠特異性的擴(kuò)增出ALV-K，種內(nèi)和種間的特異性均非常好；構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性質(zhì)粒在8.4×1010copies/μL～8.4×101copies/μL之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，y＝-3.402x+48.355，斜率為-3.402，相關(guān)系數(shù)為R2為0.998，擴(kuò)增效率Eff％為96.768；最低能夠檢測到8.4×10copies/μL的病毒，靈敏度是普通PCR的100倍；批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于5％，證明此方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)穩(wěn)定性好，擴(kuò)增效率高，可以用于臨床ALV-K的檢測。附圖說明圖1為陽性重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖(M.DNAMarker4500；1.RT-PCR產(chǎn)物；2.重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；3.陰性對(duì)照)；圖2為ALV-K實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3熒光定量RT-PCR的種內(nèi)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4熒光定量RT-PCR的種間特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5熒光定量RT-PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(1-10模板含量分別為(單位copies/μL)：8.4×1010；8.4×109；8.4×108；8.4×107；8.4×106；8.4×105；8.4×104；8.4×103；8.4×102；8.4×101)；圖6普通PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(1-9模板含量分別為(單位copies/μL)：8.4×1010；8.4×109；8.4×108；8.4×107；8.4×106；8.4×105；8.4×104；8.4×103；10為陰性對(duì)照)；圖7為ALV-K對(duì)機(jī)體生長發(fā)育的影響柱形圖；圖8不同臟器中基因拷貝數(shù)的比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施了對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立1實(shí)驗(yàn)材料毒株、細(xì)胞美國ATCC雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)、A亞群禽白血病RAV-1株(GenBank登錄號(hào)：M19113)、B亞群禽白血病RAV-2株(GenBank登錄號(hào)：M14902)、J亞群禽白血病HPRS-103株(GenBank登錄號(hào)：Z46390)、E亞群禽白血病RAV-0株(GenBank登錄號(hào)：M12172)、K亞群禽白血病GDFX0601株(GenBank登錄號(hào)：KP686142.1)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果2.1陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建參考GDFX0601株前病毒全基因組，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建：env-F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGATAC-3’(SEQIDNO.4)；env-R：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTACACTGCTCCATTTTCG-3’(SEQIDNO.5)。利用該引物對(duì)特異性的擴(kuò)增ALV-K，目的基因1850bp，瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示在1850bp附近有一條特異性的目的條帶；再以構(gòu)建的陽性質(zhì)粒為模板，得到預(yù)期大小的目的條帶(圖1)，測序結(jié)果顯示插入的基因序列與目的基因一致，結(jié)果表明陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的定量：DNA拷貝數(shù)＝{[X(g/μ本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
種用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT?PCR檢測的引物對(duì)及探針，其特征在于，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

【技術(shù)特征摘要】
1.種用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物對(duì)及探針，其特征在于，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物對(duì)及探針，其特征在于，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)K亞群禽白血病病毒序列的gp85區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于K亞群禽白血病病毒熒光定量RT-PCR檢測的引物對(duì)及探針，其特征在于，所述引物對(duì)和探針的核苷酸序列如下所示：ALV-F：5’-CCCCTGCTATTTAGGCAAGCT-3’，ALV-R：5’-AGTTGGCAAGCACCTTGAGAA-3’，ALV-Pb：5’-CCATGTTA...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊素，陳軒，蘇惠龍，邵建宏，黃海超，趙福振，沙才華，趙海燕，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44