分離百日咳桿菌保護性組分的方法技術

提供了有效分離百日咳桿菌保護性組分的方法，以對磷酸鈣凝膠的吸附能力的差異為基礎，從百日咳桿菌培養物中分離百日咳桿菌的保護性組分，所述磷酸鈣凝膠是在存在過量磷酸離子的條件下，提供將鈣離子加到百日咳桿菌培養物中而形成的。傳統上，已經用用于不同組分的不同純化方法，分離百日咳桿菌的保護性組分。根據本發明專利技術，使用同樣的方法純化所有的百日咳桿菌主要保護性組分。因此可以高效率和高回收率地純化每個組分，對于工業生產是非常有利的一個方面。還可以有效地生產改進純化的百日咳組分疫苗，該疫苗包括百日咳絲狀血細胞凝集素（ＦＨＡ），ｐｅｒｔａｃｔｉｎ（ＰＲＮ，６９Ｋ－ＯＭＰ），百日咳菌毛（ＦＩＭ）和百日咳毒素（ＰＴ）的有效組分。（*該技術在2015年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及。通過適當混合由本專利技術方法分離的保護性組分，可以制備百日咳組分疫苗。疫苗被廣泛地用于防止傳染病。百日咳，一種因感染百日咳桿菌而引起的傳染性呼吸疾病，由于窒息性(apneic)咳嗽同時偶爾伴有痙攣可能嚴重地影響患者，特別是嬰兒。為了治療這種疾病，實踐中均是使用滅活后的百日咳桿菌全培養細胞(滅活的疫苗)。但是，已經報告了在接種位點的定位反應和副反應，如發燒，從而社會上急需解決此問題。為了解決該問題， 已經進行了許多使用從百日咳桿菌中分離的保護性組分作為疫苗的嘗試。例如，通過從百日咳桿菌中提取保護性蛋白質，如百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，除去內毒素(ET)而制備無細胞百日咳疫苗(ACP疫苗)，但由于下述缺陷而并不完全令人滿意。用相應的方法分離了百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，(所有均是已經在實踐應用中有效的百日咳桿菌保護性組分)。用人結合珠蛋白作為配體的親和層析可分離百日咳毒素(PT)。但是由于人結合珠蛋白是從人血中收集的，因此可能受到肝炎病毒的污染；使用動物血清時有相同的問題。另一種方法是使用變性的血漿銅藍蛋白作為配體的親和層析(日本未審查專利No.62135/1987)。盡管該方法沒有病毒污染的問題，但產生了其他一些問題，包括血漿銅藍蛋白和硫氰酸鈉的高毒性和強身體滯留以及有蛋白質變性作用的其他洗脫劑的污染疫苗。就百日咳絲狀血細胞凝集素(PHA)來說，可利用的是使用羥基磷灰石的純化方法。但是該方法要花長時間進行柱操作而且由于羥基磷灰石的高成本而不經濟。就pertactin(PRN，69K-OMP)來說，使用小鼠血清作為配體進行親和層析，但也有上述缺陷。就百日咳菌絲(FIM)來說，通過用硫酸銨和氯化鎂鹽析來純化百日咳桿菌細胞提取物，但由于產率低該方法在疫苗生成效率方面是很差的。有一種通過用氫氧化鋁凝膠吸附而制備革蘭氏陰性菌疫苗的方法(WO93/10216)。該方法需要大量的氫氧化鋁凝膠，來吸附在革蘭氏陰性菌中產生的保護性組分和內毒素。用WO93/10216的方法得到的疫苗由于稀釋的疫苗而將內毒素釋放體內，因而有副作用，如發燒和內毒素-休克的危險。就包括組分混合物而不必分離百日咳桿菌中的每個組分的百日咳疫苗生產而言，一種可以得到的方法是使用磷酸鈣凝膠(EP-A-291968，日本未審查專利No.52726/1989)。但是在該方法中，存在1M氯化鈉的時，形成的磷酸鈣并不吸附保護性組分。如上所述，總的來講，必須使用不同的純化方法分離百日咳桿菌中的相應的保護性組分。由于辛苦的操作和實踐應用難，所以該方法不適用于疫苗的大規模生產。此外，在現有技術中公開的分離保護性組分的常規方法還存在材料或試劑有致病性或毒性的問題。針對上述背景，本專利技術人研究了有效分離百日咳桿菌的保護性組分的方法，發現在存在過量磷酸離子的條件下，向百日咳桿菌培養物中加入鈣離子，可以有效地從百日咳桿菌中分離百日咳桿菌的保護性組分。在這一發現的基礎上，本專利技術人作了進一步的研究，將有效安全分離保護性組分的方法與磷酸鈣凝膠處理和鹽洗脫以及加熱結合在一起，構成了本專利技術。因此，本專利技術涉及(1)通過將百日咳桿菌培養物與磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一種的方法，所述磷酸鈣凝膠是通過在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到培養物中而形成的。(2)通過將百日咳桿菌培養物分離到細胞和培養液中并完成(A)，(B)，(C)和(D)步驟中的至少一個步驟而分離百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一個成員的方法(A)在此步驟中，用鹽溶液洗脫分離的細胞，使洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，(B)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細胞殘留物加熱，然后與磷酸鈣凝膠接觸，通過將洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步驟中，在存在鹽溶液的條件下，將從上述步驟(A)中洗脫處理的細胞殘留物加熱，將上清液與磷酸鈣凝膠接觸并用鹽溶液洗脫，通過將洗脫的溶液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步驟中，將培養物或分離培養液與上述(1)中的磷酸鈣凝膠接觸，從所述上清液中分離百日咳毒素(PT)。(3)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后用鹽溶液洗脫以分離在步驟(A)中的百日咳絲狀血細胞凝集素。(4)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸后，與離子交換凝膠接觸，以分離步驟(B)中的pertactin(PRN，69K-OMP)。(5)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與磷酸鈣凝膠接觸，然后除去，將所得的殘留物用鹽溶液洗脫以分離步驟(C)中的百日咳菌毛(FIM)。(6)上述(2)中的分離方法，其中將所述上清液與離子交換凝膠接觸以分離步驟(D)中的百日咳毒素(PT)。(7)上述(2)中的分離方法，其中在步驟(A)和(C)中所用的鹽溶液是含堿金屬鹽的緩沖液。(8)上述(7)中的分離方法，其中所述鹽溶液是含0.01-1.0M氯化鈉的緩沖液。(9)上述(1)或(2)中的分離方法，其中，在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到pH7-9的培養物或上清液中而形成磷酸鈣凝膠。(10)上述(9)中的分離方法，其中磷酸離子和鈣離子的當量比為每當量鈣離子1.25-30當量的磷酸離子。(11)上述(9)中的方法論方法，其中存在0.05-0.1M磷酸鹽緩沖液時，加入0.1-2w/v％的醋酸鈣作為鈣離子源而形成磷酸鈣凝膠。(12)上述(1)或(2)中的分離方法，其中分離百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個成員，此后，在存在硫酸銨的條件下，吸附到氫氧化鋁凝膠上而除去內毒素。(13)上述(1)或(2)中的分離方法，其中分離百日咳毒素(PT)，百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一個成員，此后通過區離心除去內毒素。(14)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶FIM的混合比例為4-6∶8-10∶1。(15)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶∶PRN∶FIM的混合比例為2-6∶4-10∶1-1∶1。用于本專利技術的百日咳桿菌菌株不受限制，只要它能夠產生百日咳絲狀血細胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)，所有百日咳桿菌保護性組分中的一個或一個以上的成員就行。有用的菌株包括已知菌株如百日咳桿菌TohamaPhase I菌株(保存在thenational institute of Health，Ministr本文檔來自技高網...

【技術保護點】
通過將百日咳桿菌培養物與磷酸鈣凝膠接觸而分離百日咳絲狀血細胞凝集素（ＦＨＡ），ｐｅｒｔａｃｔｉｎ（ＰＲＮ，６９－ＯＭＰ），百日咳菌毛（ＦＩＭ）和百日咳毒素（ＰＴ）中的至少一個成員的方法，所述磷酸鈣凝膠是通過在存在磷酸離子的條件下，將鈣離子加到培養物而形成的。

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：末原章宏，山本英治，藤井重男，
申請(專利權)人：武田藥品工業株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]