一種多克隆抗體、制備方法及其用途技術

本發明專利技術是一種多克隆抗體。從１－（６－羥基－β－萘基）－乙基膦酸單甲酯或單乙酯為半抗原，用于二酸酐或戊二酸酐作橋梁，一個羧基與半抗原的６－羥基聯接成酯，另一個羧基與牛血清白蛋白或鑰孔＊血蘭素等載體蛋白聯接成半抗原－載體蛋白體系，經動物免疫，分出抗原血清，純化而成。不僅方法簡便，能催化萘普生酯水解，而且對手征性奈普生酯有專一選擇性，可用于拆分純化Ｓ－構型的萘普生。（*該技術在2015年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種多克隆抗體，制備方法及其用途。該多克隆抗體由1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單乙酯半抗原，通過二元酸酐作為橋梁與載體蛋白聯結而成適于動物免疫的抗原體系，再經動物免疫后獲得多克隆抗體，具有催化萘普生酯水解的能力。八十年代化學和免疫學領域中的一項重大發現催化抗體(抗體酶)(Tramontano A，Janda K.D.Lerner R.A.Catalytic Antibodies.Science，1986，2341566-1570；Pollack S.J.Jacobs J.W.，Schultz P.G.Selective Chemical Catalysis by an Antibody，Science，1986，2341570-1573)，把抗體的極其多樣性與酶的巨大催化能力等特性結合在一起，為傳統的化學和免疫學研究開辟了一個嶄新的方向。利用經過特殊的設計并合成的有機分子作為半抗原，聯結載體蛋白后免疫動物并經細胞雜交技術，從篩選和分離的單克隆抗體中，成功地獲得具有催化功能的抗體。至今已有五十多個反應能用催化抗體來催化(Schultz P.G.，Lerner R.A.，Benkovic S.J.Catalytic Anti-bodies.Chem.Eng.News 1990，May 28，P20-40；Ikeda S.，Janda K.D.Catalytic Antibody(觸媒抗體)の最近の進步と應用につぃて.有機合成化學協會志，1993，51284-297)，對某些反應(如Diels-Alder反應)，自然界不存在能催化它們的酶，也能用抗體來進行催化(Hilvert D.et al.Antibody Catalysis of a Diels-Alder Reaction.Am.Chem.Soc.1989，1119261-9262；Braisted A.C.，Schultz P.G. An Anti-body-CatalyzedBimolecular Diels-Alder Reaction. J.Am.Chem.Soc.1990，1127430-7431)。對用多克隆抗體來催化有機反應的報道甚少(Gallacher D.et all.A polyclonal antibody preparation with Michaelian catalytic proper-ties.Biochem.J.1991，279，871-881.Polyclonal antibody-catalysed amidehydrolysis.ibid 1992，284，675-680)。我們報道了1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單乙酯作為半抗原，但至今未見多克隆抗體對手性識別的報道。因此，設計具有特異性的催化抗體，在化學，生物學，醫學等領域無疑將顯示巨大的應用潛力。萘普生是一種非常重要的非甾體消炎鎮痛藥，其S構型的藥效為R構型的38倍，研究用抗體催化水解萘普生乙酯來拆分獲得S構型的萘普生，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。本專利技術的目的是提供一種多克隆抗體。本專利技術的另一目的是提供一種制備該多克隆抗體的方法。本專利技術還有一個目的是提供這種多克隆抗體的用途。本專利技術的一種多克隆抗體是以萘普生酯為水解底物，設計其膦酸酯(4)為過渡態類似物，以1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或單乙酯(4)為半抗原，用丁二酸酐或戊二酸酐為橋梁，一個羧基與半抗原的6-羥基聯結，得到適合動物免疫的半抗原-載體蛋白體系(5)， 式中R＝Me或Et，R1＝BSA或KLH，R2＝(CH2)2或(CH2)3所述的載體蛋白是牛血清蛋白或鑰孔韓血蘭素，可分別簡稱為BSA或KLH。用半抗原-載體蛋白體系(5)免疫動物，取血后分出血清，經純化得到免疫球蛋白(IgG)，即本專利技術的多克隆抗體。換言之本專利技術的多克隆是一種以1-(6-羥基-β-萘基)-乙膦酸單酯或乙酯(4)為半抗原制得的多克隆抗體。也可以說本專利技術的多克隆抗體是一種以半抗原一載體蛋白體系(5)經過免疫動物，取血分出全血清，分離純化得到多克隆抗體。本專利技術的多克隆抗體采用pH為7.3的磷酸緩沖液時毛細管電泳檢測顯示均一產物。本專利技術的多克隆抗體分子量約達150000，整個分子由四條多肽鏈組成，其中兩條相同的長鏈為重鏈，分子量各約為50000，兩條相同的輕鏈，分子量約為25000，兩條重鏈藉二硫鍵聯結起來，呈Y字形，兩條輕鏈又通過二硫鍵連接在Y字的兩側，整個抗體分子呈對稱結構。本專利技術的多克隆抗體制備方法，是以1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或乙酯(4)半抗原為原料，用丁二酸酐或戊二酸酐作橋梁，使一個羧基與6-羥基聯接成酯，另一個羧基與載體蛋白聯接，所述的載體蛋白是牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血蘭素(KLH)，得到適于動物免疫的抗體。 其中R＝Me或Et，R1＝BSA或KLH，R2＝(CH2)2或(CH2)3。具體地說在室溫下和極性溶劑中，以對-二甲氨基吡啶(簡DMAP)為催化劑，化合物(4)和丁二酸酐或戊二酸酐反應1-20小時即得化合物(6)，其中化合物(4)、丁二酸酐或戊二酸酐和催化劑的克分子比為1∶1-10∶0.1-2。推薦比例為1∶1-5∶0.8-1.5。所述的溶劑最好是吡啶。在極性溶劑中，化合物(6)與載體蛋白BSA或KLH反應0.5-10小時可獲半抗原-載體蛋白(5)。通常化合物(6)和載體的克分子比為1∶0.001-0.1，以1∶0.001-0.01為好。反應可在室溫下進行。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺縮合劑將有利于加快反應的進行，化合物(6)和縮合劑的克分子比為1∶0.5-10。通常載體蛋白溶于磷酸緩沖液后加入反應體系。上述反應所得的半抗原-載體蛋白(5)可以用半透膜透析除去小分子的未反應的半抗原和縮合劑。將半抗原-載體蛋白(5)進行動物免疫，取血分離出抗全血清，用飽和硫酸銨溶液沉淀得粗制多克隆抗體，具體地說，將半抗原-載體蛋白體系與弗氏佐劑(Freund′s adjurant)等體積混和，制成乳化疫苗，進行動物免疫，在小鼠、兔、大鼠或豚鼠等動物的頸、背和足掌等部位皮下注射疫苗作初次免疫。再次免疫時，以不完全弗氏佐劑取代初次免疫的弗氏佐劑制成疫苗以免疫動物。兩次免疫間隔時間為10-30天。最后一次免疫后7天取出血，分離出抗全血清，用40％的飽和硫酸銨溶液沉淀，得粗多克隆抗體。可以用DE-52離子交換層析分離除去其它血清蛋白，得純多克隆抗體，也可用冷凍干燥法獲純多克隆抗體粉末，能長期保存，毛細管電泳顯示均一。動物免疫證明兔的免疫效果最好，用酶聯免疫吸附法(ECISA)測定血清中半抗原的抗體滴度(O.D.值)稀釋6400倍時，其抗體滴度仍為空白對照組的3.4倍。本專利技術的多克隆抗體能催化萘普甲酯或乙酯水解生成萘普生。當催化消旋體萘普生乙酯時，其催化水解反應動力學符合Michaelis-Menten速率方程。附圖說明圖1為水解反應的底物濃度時間關系曲線，圖1中表示為對照不加催化多克隆抗體，*為加催化多克隆抗體的結果。圖2為底物濃度的倒數和其初速度倒數的關系曲線，從所得數據計算得到Vmax＝17.4±0.8μmol/L.min，K本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種多克隆抗體，其特征是以分子式為＊＊＊的化合物作為半抗原，制備半抗原－載體蛋白，經動物免疫，取血，分出抗全血清，純化制得，其中Ｒ＝Ｍｅ或Ｅｔ，Ｒ↑［１］＝ＢＳＡ或ＫＬＨ，Ｒ↑［２］＝（ＣＨ↓［２］）↓［２］或（ＣＨ↓［２］）↓［３ ］。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊炳輝，趙河，胡允金，吳毓林，季永鏞，葉敏，
申請(專利權)人：中國科學院上海有機化學研究所，中國科學院上海細胞生物學研究所，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]