使用核苷酸可逆終止子的離子傳感器DNA和RNA合成測序制造技術
The ion sensors DNA and RNA were synthesized and sequenced using the nucleotide reversible Terminator
The present invention relates to the use of an ion sensing field effect transistor and a reversible nucleotide terminator to determine the identity of a nucleotide residue of a single stranded DNA or RNA in a solution, or to sequence a DNA or RNA.
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】使用核苷酸可逆終止子的離子傳感器DNA和RNA合成測序本申請要求于2014年5月19日提交的第62/000,306號美國臨時申請的優先權，其全部內容通過引用并入本文。本申請通過引用并入名為“150518_0575_82337-PCT_SequenceListing_JAK.txt”的文件中記載的核苷酸和/或氨基酸序列，此文件大小為1千字節，于2015年5月18日以IBM-PC機格式創建，與MS-Windows的操作系統兼容，且作為本申請的一部分包含在于2015年5月18日提交的文本文件中。本專利技術受到政府的支持，在美國國立衛生研究院授予的基金號HG003582和HG005109下進行。美國政府對本專利技術有一定的權利。在本申請全文中，在括號中引用了某些出版物。在權利要求之前緊挨著權利要求可以找到這些出版物的完整引用。這些出版物的全部公開通過引用并入本申請以便更充分地描述本專利技術所涉及的現有技術。
技術介紹
從像生態學和進化這樣不同的領域到基因發現和個性化醫療，高通量測序已成為基本所有現代生物學領域的基本支持技術。通過在其所有變體中使用大規模平行測序，可以鑒定整個生命樹中基因之間的同源性，以檢測個人的單核苷酸多態性(SNP)、變體拷貝數和基因組重排，詳細表征轉錄組及其轉錄因子結合位點，并提供表觀基因組的詳細的甚至完整的視圖(Hawkinsetal.2010；Morozovaetal.2009；Parketal.2009)。為了向前推進個性化醫療領域，必須為包括具有范圍廣泛的復雜疾病的個體在內的所有地緣種族群體的代表性樣品收集完整的基因型和表型信息。擁有這樣的數...
【技術保護點】
在溶液中確定單鏈DNA的核苷酸殘基的身份的方法，其包括：(a)使具有與其一部分雜交的引物的單鏈DNA與DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)類似物在下述條件下接觸：如果所述dNTP類似物與單鏈DNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與所述引物的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基，則允許所述DNA聚合酶催化將所述dNTP類似物并入至所述引物中從而形成DNA延伸產物，其中(1)所述dNTP類似物具有以下結構：
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.05.19 US 62/000,3061.在溶液中確定單鏈DNA的核苷酸殘基的身份的方法，其包括：(a)使具有與其一部分雜交的引物的單鏈DNA與DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)類似物在下述條件下接觸：如果所述dNTP類似物與單鏈DNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與所述引物的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基，則允許所述DNA聚合酶催化將所述dNTP類似物并入至所述引物中從而形成DNA延伸產物，其中(1)所述dNTP類似物具有以下結構：其中B為堿基并且為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'為(i)-CH2N3或2-硝基芐基，或(ii)質量小于300道爾頓的烴基或取代烴基；以及(b)通過確定溶液的氫離子濃度是否增加來確定在步驟(a)中所述dNTP類似物是否并入了引物以形成DNA延伸產物，其中(i)如果所述dNTP類似物已并入引物，根據并入的dNTP類似物的身份確定所述單鏈DNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈DNA中的核苷酸殘基的身份，以及(ii)如果氫離子濃度沒有變化，重復進行步驟(a)，其中在步驟(a)的每次重復中，dNTP類似物包含的堿基的類型與步驟(a)的每次在前重復中dNTP類似物的堿基的類型不同，直到dNTP類似物并入引物以形成DNA延伸產物，并根據并入的dNTP類似物的身份確定單鏈DNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈DNA中核苷酸殘基的身份。2.在溶液中確定單鏈DNA中連續核苷酸殘基的序列的方法，其包括：(a)使具有與其一部分雜交的引物的單鏈DNA與DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)類似物在下述條件下接觸：如果所述dNTP類似物與單鏈DNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與所述引物的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基，則允許所述DNA聚合酶催化將所述dNTP類似物并入至所述引物中從而形成DNA延伸產物，其中(1)所述dNTP類似物具有以下結構：其中B為堿基并且為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'為(i)-CH2N3或2-硝基芐基，或(ii)質量小于300道爾頓的烴基或取代烴基；以及(b)通過檢測溶液的氫離子濃度的增加來確定在步驟(a)中所述dNTP類似物是否并入，其中氫離子濃度的增加表明所述dNTP類似物已經并入引物以形成DNA延伸產物，如果溶液的氫離子濃度增加，則根據并入的dNTP類似物的身份確定所述單鏈DNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈DNA中的核苷酸殘基的身份，并且其中氫離子濃度沒有變化表明在步驟(a)中所述dNTP類似物沒有并入引物中；(c)如果在步驟(b)中未檢測到氫離子濃度的變化，重復進行步驟(a)和(b)，其中在針對正被測定身份的指定核苷酸殘基的步驟(a)的每次重復中，dNTP類似物包含的堿基的類型與針對所述核苷酸殘基的步驟(a)的每次在前重復中dNTP類似物的堿基的類型不同，直到dNTP類似物并入引物以形成DNA延伸產物，并根據并入的dNTP類似物的身份確定所述單鏈DNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈DNA中核苷酸殘基的身份；(d)如果已檢測到氫離子濃度的增加并且并入了dNTP類似物，則隨后處理并入的dNTP核苷酸類似物以便用H原子代替其R'基團，從而在DNA延伸產物的3'端提供3'OH基團；以及(e)根據需要，對待測序的單鏈DNA的連續核苷酸殘基的每個核苷酸殘基重復進行步驟(a)至(d)，除了：在步驟(a)的每個重復中，(i)dNTP類似物并入由步驟(a)或步驟(c)的在前重復產生的DNA延伸產物中，并且(ii)dNTP類似物與單鏈DNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與由步驟(a)或步驟(c)的在前重復產生的DNA延伸產物中的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈DNA的核苷酸殘基，從而形成隨后的DNA延伸產物；條件是對于待測序的最后一個核苷酸殘基，步驟(d)是任選的，由此確定所述單鏈DNA的連續核苷酸殘基中每一個核苷酸殘基的身份，從而確定所述DNA的連續核苷酸殘基的序列。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中R'為-CH2N3；其中R'為取代烴基且為硝基芐基；其中R'為2-硝基芐基；或者其中R'為烴基且為烯丙基(-CH2-CH＝CH2)。4.根據權利要求1或2所述的方法，其中在每個dNTP類似物中，R'具有以下結構：其中Rx獨立地為質量小于300道爾頓的取代或未取代的C1-C5烷基、C2-C5烯基或C2-C5炔基，或為H，其中波浪線表示與3'氧原子的連接點；或其中R'具有以下結構：其中波浪線表示與3'氧原子的連接點。5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述DNA在設置在傳感器上的反應室內的溶液中，所述傳感器(i)形成在半導體襯底中，并且(ii)包括場效應晶體管或化學場效應晶體管，所述場效應晶體管或化學場效應晶體管被配置為用于響應由核苷三磷酸或核苷三磷酸類似物與引物或DNA延伸產物之間磷酸二酯鍵的形成引起的溶液氫離子濃度增加而提供至少一個輸出信號。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述反應室是設置在傳感器陣列上的多個反應室之一，所述傳感器陣列形成于半導體襯底中且包括多個傳感器，每個反應室設置在至少一個傳感器上，且陣列中的每個傳感器包括場效應晶體管或化學場效應晶體管，所述場效應晶體管或化學場效應晶體管被配置為用于響應由核苷三磷酸或核苷三磷酸類似物與引物或DNA延伸產物之間磷酸二酯鍵的形成引起的溶液氫離子濃度增加而提供至少一個輸出信號。7.根據權利要求6所述的方法，其中所述陣列的每個所述傳感器占據100μm或更小的面積并具有10μm或更小的間距，并且其中每個所述反應室具有1μm3至1500μm3范圍內的容積；或其中每個所述反應室容納溶液中的至少105個單鏈DNA拷貝。8.根據權利要求6和7中任一項所述的方法，其中所述多個反應室和所述多個傳感器各自的數目均大于256,000。9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述溶液中的單鏈DNA被連接至固體基質；其中所述溶液中的引物被連接至固體基質；其中所述單鏈DNA或引物通過1,3-偶極疊氮化物-炔烴環加成化學反應連接至固體基質；其中所述單鏈DNA或引物通過聚乙二醇分子連接至固體基質；其中所述單鏈DNA或引物通過聚乙二醇分子連接至固體基質且是疊氮基官能化的；其中所述DNA或引物通過疊氮基連接、炔基連接或生物素-鏈霉親和素相互作用連接至固體基質；其中所述DNA或引物是炔標記的；其中所述DNA或引物被連接至固體基質，所述固體基質為以下形式：芯片、珠、孔、毛細管、載玻片、晶片、過濾器、纖維、多孔介質、基質、多孔納米管或柱；其中所述DNA或引物被連接至固體基質，所述固體基質為金屬、金、銀、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃、尼龍或金剛石；其中所述DNA或引物被連接至固體基質，所述固體基質是附著有或浸漬有金屬或金屬組合的多孔非金屬物質；其中所述DNA或引物被連接至固體基質，所述固體基質又被連接至第二固體基質；或其中所述DNA或引物被連接至固體基質，所述固體基質又被連接至第二固體基質，所述第二固體基質為芯片。10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中1×109個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×108個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中2×107個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×107個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×106個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×104個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；或其中1,000個或更少的DNA或引物拷貝被連接至固體基質。11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中10,000個或更多的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×107個或更多的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；其中1×108個或更多的DNA或引物拷貝被連接至固體基質；或其中1×109個或更多的DNA或引物拷貝被連接至固體基質。12.根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述DNA或引物隔開在獨立的隔室、孔或固體表面上的凹陷中。13.根據權利要求1-12中任一項所述的方法，其在多個單鏈DNA上平行進行，并且其中任選地所述單鏈DNA是具有相同序列的模板。14.根據權利要求13所述的方法，其還包括在步驟(b)或(c)中已確定核苷酸殘基的殘基后，視情況使所述多個單鏈DNA或模板與雙脫氧核苷三磷酸接觸，從而永久地封閉任何未延伸的引物或未延伸的DNA延伸產物，所述雙脫氧核苷三磷酸與已被鑒定的核苷酸殘基互補。15.根據權利要求13或14中任一項所述的方法，其中在步驟(a)之前從DNA樣品擴增單鏈DNA；并且其中任選地通過聚合酶鏈式反應擴增單鏈DNA。16.根據權利要求1-15中任一項所述的方法，其中紫外光用于處理并入引物或DNA延伸產物的dNTP類似物的R'基團，以便光化學裂解連接到3'-O的部分從而用3'-OH代替3'-O-R'；其中所述部分任選為2-硝基芐基部分。17.在溶液中確定單鏈RNA的核苷酸殘基的身份的方法，其包括：(a)使具有與其一部分雜交的RNA引物的單鏈RNA與聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)類似物在下述條件下接觸：如果所述rNTP類似物與單鏈RNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與RNA引物的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基，則允許所述聚合酶催化將所述rNTP類似物并入至所述RNA引物中從而形成RNA延伸產物，其中(1)rNTP類似物具有以下結構：其中B為堿基并且為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'為(i)-CH2N3或2-硝基芐基，或(ii)質量小于300道爾頓的烴基或取代烴基；以及(b)通過確定溶液的氫離子濃度是否增加來確定在步驟(a)中所述rNTP類似物是否并入了RNA引物以形成RNA延伸產物，其中(i)如果所述rNTP類似物已并入RNA引物，根據并入的rNTP類似物的身份確定所述單鏈RNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈RNA中的核苷酸殘基的身份，以及(ii)如果氫離子濃度沒有變化，則重復進行步驟(a)，其中在步驟(a)的每次重復中，rNTP類似物包含的堿基的類型與步驟(a)的每次在前重復中rNTP類似物的堿基的類型不同，直到rNTP類似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸產物，并根據并入的rNTP類似物的身份確定所述單鏈RNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈RNA中核苷酸殘基的身份。18.在溶液中確定單鏈RNA中連續核苷酸殘基的序列的方法，其包括：(a)使具有與其一部分雜交的RNA引物的單鏈RNA與RNA聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)類似物在下述條件下接觸：如果所述rNTP類似物與所述單鏈RNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與所述RNA引物的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基，則允許所述RAN聚合酶催化將所述rNTP類似物并入至所述RNA引物中從而形成RNA延伸產物，其中(1)所述rNTP類似物具有以下結構：其中B為堿基并且為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'為(i)-CH2N3或2-硝基芐基，或(ii)質量小于300道爾頓的烴基或取代烴基；以及(b)通過檢測溶液的氫離子濃度的增加來確定在步驟(a)中所述rNTP類似物是否并入，其中氫離子濃度的增加表明所述rNTP類似物已經并入RNA引物以形成RNA延伸產物，如果溶液的氫離子濃度增加，則根據并入的rNTP類似物的身份確定所述單鏈RNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈RNA中的核苷酸殘基的身份，并且其中氫離子濃度沒有變化表明在步驟(a)中rNTP類似物沒有并入RNA引物中；(c)如果在步驟(b)中未檢測到氫離子濃度的變化，重復進行步驟(a)和(b)，其中在針對正被測定身份的指定核苷酸殘基的步驟(a)的每次重復中，rNTP類似物包含的堿基的類型與針對所述核苷酸殘基的步驟(a)的每次在前重復中rNTP類似物的堿基的類型不同，直到rNTP類似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸產物，并根據并入的rNTP類似物的身份確定所述單鏈RNA中與其互補的核苷酸殘基的身份，由此確定所述單鏈RNA中核苷酸殘基的身份；(d)如果已檢測到氫離子濃度的增加并且并入了rNTP類似物，則隨后處理并入的rNTP核苷酸類似物以便用H原子代替其R'基團，從而在RNA延伸產物的3'端提供3'OH基團；以及(e)根據需要，對待測序的單鏈RNA的連續核苷酸殘基的每個核苷酸殘基重復進行步驟(a)至(d)，除了：在步驟(a)的每次重復中，(i)rNTP類似物并入由步驟(a)或步驟(c)的在前重復產生的RNA延伸產物中，并且(ii)rNTP類似物與單鏈RNA的核苷酸殘基互補，所述核苷酸殘基在5'方向上緊挨著與由步驟(a)或步驟(c)的在前重復產生的RNA延伸產物中的3'末端核苷酸殘基雜交的所述單鏈RNA的核苷酸殘基，從而形成隨后的RNA延伸產物；條件為對于待測序的最后一個核苷酸殘基，步驟(d)是任選的，由此確定所述單鏈RNA的連續核苷酸殘基中每個核苷酸殘基的身份，從而確定所述RNA的連續核苷酸殘基的序列。19.根據權利要求17或18所述的方法，其中R'為-CH2N3；其中R'為取代烴基且為硝基芐基；其中R'為2-硝基芐基；或者其中R'為烴基且為烯丙基(-CH2-CH＝CH2)。20.根據權利要求17或18所述的方法，其中在每個rNTP類似物中，R'具有以下結構：其中Rx獨立地為質量小于300道爾頓的取代或未取代的C1-C5烷基、C2-C5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：靜岳·具，詹姆士·J·魯索，于林，
申請(專利權)人：哥倫比亞大學董事會，
類型：發明
國別省市：美國,US
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