公開了一種制備干擾素α－２晶體的方法及其在貯庫制劑中的應用。（*該技術在2011年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
人干擾素α是一類至少包含24個亞種的蛋白(Zoon K.C.，Interferon9∶1-12，1987，Gresser I.編，Academic Press，New York)。它們原來被描述為能夠在細胞內誘導抗病毒狀態的藥劑，但現在被稱為影響免疫系統許多功能的多效性淋巴激活素(Opdenakker等，Experimentia 45∶513-520，1989)。除了其體外生物活性外，人干擾素α目前用于幾種重要的指征，例如毛細胞性白血病、卡波濟肉瘤、尖銳濕疣等，并正在研究將其用于其他幾種指征(Intron A(干擾素α-2b)Clinical Status(1989))。這是從1989年9月在英國倫敦召開的第五屆歐洲臨床腫瘤學大會的一個附屬討論會上得來的進展。對結構的闡明及各種劑型的配制來說，最為重要的是要得到高度純化的結晶態干擾素α，尤其是重組型α-2b。現已報道了兩種形式的結晶人干擾素α-2(Miller等，Science 215689-690，1982;Kung等，美國專利4，672，108;Weissmann，“干擾素的克隆及其它錯誤”，Interferon 1981，Ion Gresser編，Academic Press，New York，101-134;Weissmann，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，B2997-28，1982;Nagabhusban等，“遺傳工程α-2干擾素的定性鑒定”，InterferonResearch，Clinical Application and RegulatoryConsideration，Zoon等編，Elsevier，New York79-88，1982)。這些出版物敘述了在低溫下從聚乙二醇中結晶干擾素α-2的方法，或者通過調節PH或溫度而從磷酸鹽緩沖液中結晶干擾素α-2的方法。通常用這些方法得到的針狀結晶，用X射線衍射技術難以準確鑒定其特性。Miller等人的文章還提到了“棱狀”結晶干擾素α-2。一般來說，對干擾素這樣的蛋白質進行結晶的方法是無法預言的。例如，Kung等人的美國專利4，672，108(1987)在第1欄第52-64行特別指出“現已建立了多種蛋白質結晶技術，但尚未發現通用的方法，因此許多蛋白質仍未結晶出來。所以，蛋白質的結晶是一門無法預言的技術，需要對許多可供選擇的可能方法作反復試驗。應用最為廣泛的方法之一，涉及在蛋白質溶液中加入一種結晶劑，通常是一種鹽(例如硫酸銨或檸檬酸銨)或一種有機溶劑(例如乙醇或2-乙基-2，4-戊二醇)。但這些方法并未提供生產人白細胞干擾素結晶的合適手段。”(加了著重號。)我們現已意外地發現了一種即使在室溫下也能有效地產生高質量結晶干擾素α-2的方法，該方法包括使干擾素α-2的溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。最好利用超濾法或透析法，或采用液滴(如懸滴或夾滴)來實現平衡。干擾素α-2的溶液最好含有一種硫酸鹽，并且該溶液最好與濃度更高的硫酸鹽溶液平衡。該硫酸鹽優選銨鹽、鈣鹽、鎘鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽或鈉鹽，更為優選的是硫酸銨。開始形成結晶時硫酸鹽在結晶干擾素α-2溶液中的濃度最好為約12%至30%飽和，更為優選的是濃度為約15%至25%飽和的硫酸銨。如下面所指出的，平衡步驟開始時硫酸鹽的濃度較低，即約2%至18%飽和。優選的干擾素α-2為干擾素α-2b，更為優選的是人的重組結晶干擾素α-2b。在一個實施方案中，結晶物為具有如下所示氨基酸順序的干擾素α-2b 也可采用干擾素α-2a。干擾素α-2a的一級氨基酸順序與上述干擾素α-2b順序的不同之處在于，23位殘基處由賴氨酸置換了精氨酸。干擾素α-2的硫酸鹽溶液最好含有一種緩沖液，其pH為6.5至8.5，較為優選的是7.3至8.0，例如磷酸鈉緩沖液。由上述方法制得的結晶干擾素α-2可作為晶種而用于制備另一批結晶干擾素α-2。如前面所指出的，本專利技術的方法包括使干擾素α-2的硫酸鹽溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使結晶干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。可以采用任何適宜的干擾素α-2，例如干擾素α-2a和干擾素α-2b，更為優選的是人的重組干擾素α-2a(r-h-干擾素α-2a)或干擾素α-2b(r-h-干擾素α-2b)。商品α-2干擾素制劑可從Hoffmann-La Roche公司(Roferon )和先靈公司(Intron A)得到。含有各種α-2干擾素的純凈干擾素混合物可從Burroughs-Wellcome公司(Wellferon )得到。鑒于人干擾素α中有高度的順序同源性，本專利技術的方法應對每一亞種都適用。人干擾素α-2各亞種可通過重組DNA技術來制取，也可以從天然來源(如人外周血淋巴細胞、人類淋巴母細胞系)純化，例如如Pestka等人所述(Ann.Rev.Biochem.，56∶727-777，1987)。優選的干擾素α-2是具有上述氨基酸順序的r-h-干擾素α-2b。天然人干擾素α已從若干細胞來源中純化出來，其中包括從全血中分離出的白細胞、新生成纖維細胞、類淋巴母細胞及各種白血病細胞系。首先應用于臨床的人白細胞干擾素制劑是由芬蘭的K.Cantell及其同事研制的，他們的方法是將取自正常供血者的血液離心后注入干擾素，加入仙臺病毒進行誘導并離心。所得上清液用硫氰酸鉀沉淀，用乙醇提取，經pH沉淀后對磷酸鹽緩沖液透析(K.E.Morgensen，L.Cantell，Pharmacol.Ther.1∶369-381，1977)。重組干擾素α已由幾個研究小組克隆出來并在大腸桿菌中表達(例如C.Weissmann等，Science 209∶1343-1349，1980)。有幾個研究小組描述了純化重組α-2干擾素的方法，該方法配合使用了一些層析步驟，例如硫酸銨沉淀、染料親和層析、離子交換和凝膠過濾，例如如Weissmann，C.所述(Phil.R.Soc.(Lond)，b299∶7-28，1982)。另一種純化重組干擾素α的方法采用了免疫親和層析法和固定化抗體(P.P.Trotta等，Developments in Industrial Microbiology，72∶53-64，Elsevier，Amsterdam)。有關用于重組α干擾素的現有純化方案的綜述，參見T.L.Nagabhushan和P.P.Trotta，《Ullmann工業化學大全》，A14，VCH，Weinheim(聯邦德國)，372-374，1989。所用的干擾素α-2b最好用該綜述所述的常規純化方法純化，然后進行反相高效層析。適宜的平衡方法包括透析、超濾，例如透濾，或者利用液滴，例如懸滴或夾滴。可以用濃度高于干擾素α-2的硫酸鹽溶液的另一種硫酸鹽溶液實現平衡。一種特別優選的方法是使r-h-干擾素α-2的溶液與使用磷酸鹽緩沖液的硫酸鹽溶液平衡。平衡過程最好緩慢進行，例如長達2-30天。大規模的結晶可以用相當于蒸氣擴散的方法來進行，即利用透析和超濾。在臨床制備過程中，可以利用大規模結晶作為純化或濃縮步驟。此外，在這種操作中可以用其它常用硫酸鹽代替硫酸銨。結晶時，即首次出現結晶時，干擾素本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備結晶干擾素α－２的方法，該方法包括：使含有干擾素α－２的硫酸鹽溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α－２溶液變得更濃，從而形成干擾素α－２結晶。
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：保羅賴歇特，杰拉爾德S哈蒙德，洪V李，塔坦納哈里L納加布胡山，保羅P特羅塔，
申請(專利權)人：先靈公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。