從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法技術

本發明專利技術公開了一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法。具體步驟如下：１）制備血漿，取新鮮血液，離心，除去紅細胞，得到血漿。２）無機鹽沉淀，向血漿中加入無機鹽達到一定濃度，產生沉淀后離心分離，沉淀即纖維蛋白原，取上清液后續分離。３）柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。４）脫鹽和干燥，將收集液脫鹽后，冷凍干燥，得到純度約７０％的免疫球蛋白。本發明專利技術所開發方法的特色在于設計了一條新的分離工藝，可以同時從畜禽血液中分離出纖維蛋白原和免疫球蛋白，方法的關鍵在于從沉淀分離纖維蛋白原的上清液中直接提取免疫球蛋白，具有操作步驟簡單，分離純化因子高的優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種從畜禽血液中同時分離出纖維蛋白原和免疫球蛋白的方 法，屬于生物活性物質的分離純化
技術背景近年來，全球以規模化、集約化經營為特點的養殖業飛速發展，大幅度提 高了人們生活水平，但是畜禽廢棄物(糞便、屠宰下腳料、血液等)的大量排 放也給生態環境帶來巨大壓力。這些廢棄物，尤其是血液，含有豐富的蛋白質、 多種微量元素、維生素和礦物質，具有很高的營養價值，但是任意排放卻造成 了嚴重的環境污染，并可能導致一些疾病的發生。充分而有效地利用畜禽血液 資源，不僅能減輕環境污染，而且可以變廢為寶，制備出高附加值產品。我國，每年產生的畜禽血液的量非常大，以我國最大量的畜禽血液豬血為例，我國每年出欄生豬約4億頭，年豬血產量可達100萬噸。目前除部分豬血 被加工成血粉，作為飼料添加劑及用于生化制藥外，大部分沒有被利用而自然 排放，造成了資源嚴重浪費和增加了環境處理的壓力。豬血中的纖維蛋白原， 是構成血液凝塊的主要骨架，可以制備纖維蛋白封閉劑，是新一代生物止血材 料，用于外科急性止血。豬血中免疫球蛋白含量高達2%，具有抗菌、抗病毒等 生物活性和免疫活性，有潛在的醫藥用途。其它的畜禽血液同樣富含纖維蛋白 原和免疫球蛋白，開發合適的分離工藝，從畜禽血液中提取多種高附加值的蛋 白產品，實現多產物聯產，具有良好的應用前景。血液組分復雜，在體內很穩定，離體后卻很快會發生一系列生化變化，如凝 血、溶血、氧化等。血液蛋白的分離純化過程十分復雜，需要一系列有效的生 化分離手段。鹽析沉淀是蛋白質分離的有效方法，也是從血液中分離纖維蛋白 原的主要方法，不過鹽析后上清液的鹽濃度仍較高，嚴重影響了后續的分離純 化，直接排放又會造成環境污染。因此，尋找一種有效的耐鹽的分離方法是關 鍵。混合模式吸附層析是近年來發展起來的新型層析技術，功能配基同時含有 疏水基團和離子交換基團，可以通過靜電相吸來強化吸附或靜電排斥來協助解 吸，配基密度通常比較高，吸附容量大，具有典型的耐鹽吸附特性，特別適合 于大規模的分離純化。本專利技術將混合模式吸附層析與鹽析分離相結合，用混合 模式吸附劑直接處理鹽析沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、 抗體選擇行和耐鹽吸附的特性，建立起一個同時從禽畜血液中提取纖維蛋白原和免疫球蛋白的經濟高效方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白 的方法。包括如下步驟-1) 制備血漿配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮畜禽血液與抗凝劑按照9: 1 的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，除去紅細 胞，得到血槳，置于-20 -40。C冰箱中備用；2) 無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原向步驟1)得到的新鮮血漿中加入飽和無機鹽溶液，使其飽和度達到16 22 %,室溫下靜置30分鐘，待沉淀完全，用離心機以4000 5000rpm轉速離心10 20分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液；3) 混合模式吸附層析分離免疫球蛋白調節步驟2)得到的免疫球蛋白粗品溶液的pH至7 8，使其與平衡緩沖液 的pH相同，用0.2^濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中， 平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；4) 脫鹽和干燥將步驟3)得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。 所述的畜禽血液為新鮮的豬血、牛血、雞血、鴨血或鵝血。無機鹽為硫酸 銨或硫酸鈉。混合模式吸附劑為MEPHypercel或以4-巰乙基吡啶為功能配基的 層析介質。平衡緩沖液為檸檬酸鈉緩沖液，pH值為7.0 8.0。洗脫液為擰檬酸 鈉緩沖液，pH為3.5 4.5。本專利技術針對畜禽血液資源的綜合利用，將鹽析分離與混合模式吸附層析相 結合，用于纖維蛋白原和免疫球蛋白的分離純化。用混合模式吸附劑直接處理 鹽析沉淀分離纖維蛋白原后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量提 高過程的處理量、抗體的高選擇性提高分離的效率、耐鹽吸附的特性簡化分離 步驟，得到一個經濟高效的提取纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法。本專利技術的優 點在于1)同時提取纖維蛋白原和免疫球蛋白；2)工藝簡單，易于放大，成 本較低廉；3)過程處理量大，分離效率高；4)所得免疫球蛋白的純度較高。 附圖說明附圖是本專利技術MEPHypercd混合模式吸附層析分離豬血漿免疫球蛋白的電泳譜圖。 具體實施例方式本專利技術提供一種。 將新鮮抗凝血離心去除紅細胞，得到血漿后，用飽和無機鹽沉淀得到其纖維蛋 白原，將上清液通過混合模式吸附層析柱進行分離，得到免疫球蛋白。通過本專利技術分離得到的免疫球蛋白純度約70%。包括如下步驟1) 制備血漿配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新畜禽鮮血液與抗凝劑按照9: 1的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，除去紅細 胞，得到血漿，置于-20 -40。C冰箱中備用。2) 無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原向步驟1)得到的新鮮血槳中加入飽和無機鹽溶液，使其飽和度達到16 22 % ，室溫下靜置30分鐘，待沉淀完全，用離心機以4000 5000rpm轉速離心10 20分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液。3) 混合模式吸附層析分離免疫球蛋白調節步驟2)得到的免疫球蛋白粗品溶液的pH至7 8，使其與平衡緩沖液 的pH相同，用0.2拜濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中， 平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；平衡 緩沖液和洗脫液均為檸檬酸鈉緩沖液，pH值分別為7.0 8.0和3.5 4.5。4) 脫鹽和干燥將步驟3)得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。 以下通過實施例對本專利技術作進一步的描述 實施例1取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入1.9ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到16%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心10分鐘，得到濕沉淀0.22g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液10.8ml，備用。上清液用0.2拜濾膜過濾，取lml作為進樣樣品。層析 柱(內徑lcm)中填充約5ml MEP Hypercel混合模式介質，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫液為20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白，電泳分析免疫球蛋白的純度為68.2%。實施例2取新鮮豬血，按照9:1的比例加入0.1M的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心機以 3000rpm轉速離心IO分鐘，除去紅細胞，得到血漿。取10ml血漿，加入2.0ml 飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度達到17%，室溫下靜置30分鐘，待纖維蛋白原 沉淀完全，以4000rpm離心15分鐘，得到濕沉淀0.27g，即為纖維蛋白原粗品， 上清液llml，備用。上清液用0.2pm濾膜過濾，取2ml作為進樣樣品。層析柱 (內徑lcm)中填充約5ml MEP Hypercel混合模式介質，平衡緩沖液為40mM 的檸檬酸鈉緩沖液(pH7.0)，洗脫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從畜禽血液中同時分離纖維蛋白原和免疫球蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟：　１）制備血漿　配置０．１Ｍ的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮畜禽血液與抗凝劑按照９∶１的比例混合均勻，用離心機以２５００～３０００ｒｐｍ轉速離心１０～ ２０分鐘，除去紅細胞，得到血漿，置于－２０～－４０℃冰箱中備用；　２）無機鹽沉淀法分離纖維蛋白原　將飽和無機鹽溶液加入到步驟１）得到的新鮮血漿中，使無機鹽的飽和度達到１６～２２％，室溫下靜置３０分鐘，待沉淀完全，用離心機以４００ ０～５０００ｒｐｍ轉速離心１０～２０分鐘，收集沉淀為纖維蛋白原，得到上清液，為免疫球蛋白粗品溶液；　３）混合模式吸附層析分離免疫球蛋白　調節步驟２）得到的免疫球蛋白粗品溶液的ｐＨ至７～８，使免疫球蛋白粗品溶液與平衡緩沖液的ｐＨ相 同，用０．２μｍ濾膜過濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，得到免疫球蛋白溶液；　４）脫鹽和干燥　將步驟３）得到的免疫球蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：林東強，莊甜甜，姚善涇，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：86[中國|杭州]