一種中性粒細胞抗原底片的制備方法技術

本發明專利技術公開了一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，包括以下步驟：將人的肝素抗凝血與的氯化鈉溶液混合均勻，室溫放置，吸取上層血漿；將上層血漿加入含有DextranT500的人淋巴細胞分離液中，充分混勻，離心，吸取沉淀在底部的白細胞層溶液，得到待離心溶液；將所述待離心溶液與LymphoprepTM分離液混合后，加入離心管中，將離心管置于水平式離心機內離心；吸取中性粒細胞層溶液，制備細胞懸浮液；將細胞懸浮液滴加在干凈的載玻片上，自然風干，最后無水乙醇固定，得到中性粒細胞抗原底片。本發明專利技術的制備方法，解決了現有制備中性粒細胞抗原底片的方法中，存在中性粒細胞分布不均勻的問題，反應結果易觀察。

Method for preparing negative neutrophil antigen film

The invention discloses a preparation method of neutrophil antigen negative, which comprises the following steps: the anticoagulant heparin and Sodium Chloride Solution are mixed evenly, at room temperature, draw the upper plasma; the upper plasma adding human lymphocyte separation medium containing DextranT500, mixing, centrifugation, precipitation from white cell layer solution at the bottom of the centrifuge to obtain solution; the solution is mixed with LymphoprepTM for centrifugal separation liquid, into a centrifugal tube, the centrifugal tube is placed in a horizontal centrifuge; absorb the neutrophil layer solution, cell suspensions were prepared; the cell suspension was added to dry naturally on clean slides on finally, fixed, ethanol, neutrophil antigen negative get. The preparation method of the invention solves the problem that the distribution of neutrophils is not uniform in the method of preparing the negative neutrophil antigen negative plate, and the reaction result is easy to observe.

【技術實現步驟摘要】
一種中性粒細胞抗原底片的制備方法
本專利技術屬于抗原底片制備
，具體涉及一種中性粒細胞抗原底片的制備方法。
技術介紹
抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophilcytoplasmicantibody，ANCA)，指與中性粒細胞及單核細胞胞漿中溶酶體酶發生反應的抗體。對系統性血管炎炎癥性腸病等多種疾病的診斷和鑒別診斷具有重要的意義，已成為自身免疫性疾病的一項非常重要的常規檢測項目。間接熒光免疫方法是檢測ANCA的參考方法或者標準方法，至今也是最常用的經典方法。該方法檢測ANCA之前通常需要制備能與其發生反應的中性粒細胞抗原底片，當ANCA與中性粒細胞發生反應后，則可進行結果觀察。現有技術中，使用乙醇固定的中性粒細胞是最常用的抗原底片制備方法之一，首先將分離出的中性粒細胞涂布于載玻片上，然后通過乙醇固定，形成抗原底片，但是該方法制備的抗原底片存在細胞分布不均勻的問題，從而，當中性粒細胞與抗體反應后，不易觀察反應結果，影響ANCA檢測結果的觀察判斷。
技術實現思路
本專利技術提供的一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，解決了現有制備中性粒細胞抗原底片的方法中，存在中性粒細胞分布不均勻的問題，反應結果易觀察。本專利技術提供的一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，包括以下步驟：步驟1，將人的肝素抗凝血與0.5g/100g的氯化鈉溶液按照4～6:1的體積比例混合均勻，室溫放置，直至紅細胞沉淀，吸取上層血漿，備用；步驟2，將上層血漿加入含有DextranT500的人淋巴細胞分離液中，充分混勻，然后室溫、3000r/min離心10-15min，吸取沉淀在底部的白細胞層溶液，得到待離心溶液；其中，每100mL人淋巴細胞分離液中添加1.5g的DextranT500；步驟3，將所述待離心溶液與LymphoprepTM分離液按1:3～5的體積比例混合后，加入離心管中，將離心管置于水平式離心機內，室溫、1000-2000r/min離心30-35min；步驟4，吸取中性粒細胞層溶液，加入4℃預冷的緩沖液，4℃、1000r/min離心5-10min，棄上清，收集細胞沉淀；每升所述緩沖液中由以下組分制備而成：5g的氯化鈉、3g的氯化鉀，蒸餾水定容至1L；步驟5，向細胞沉淀中添加4℃預冷的0.8-0.9g/100g氯化鈉溶液，使細胞數為5～5.5×105mL，得到細胞懸浮液；步驟6，將細胞懸浮液滴加在干凈的載玻片上，自然風干，最后滴加4℃預冷的無水乙醇，固定5-8min，自然風干后得到中性粒細胞抗原底片。優選的，上述中性粒細胞抗原底片的制備方法中，步驟1中，室溫放置的時間為30-40min。優選的，上述中性粒細胞抗原底片的制備方法中，所述離心管的結構包括：接收管和套設于接收管內的過濾管，所述過濾管內橫向固定有過濾網，所述過濾網的網孔直徑為0.4-0.6μm，圍繞所述過濾管的外壁設有環形限位板，并且所述環形限位板蓋合在所述接收管的管口上，并且所述環形限位板與所述接收管的管口通過橡膠圈密封，所述過濾管的上端設有用于蓋合過濾管上管口的蓋子，所述過濾管的下端開設有下管口，所述過濾管的下管口與所述接收管內底部之間留有一定距離。優選的，上述中性粒細胞抗原底片的制備方法中，步驟2還包括對步驟1中紅細胞沉淀中的中性粒細胞的收集，具體為：用4℃、2g/100g的氯化鈉溶液溶解紅細胞沉淀，加入0.01mol/L、pH為7.0的PBS，充分混勻后靜置5-10min，再4℃、1000r/min離心5-10min，收集上清液；將上清液與白細胞層溶液混合，得到待離心溶液。與現有技術相比，本專利技術提供的一種中性粒細胞抗原底片的制備方法具有以下有益效果：(1)解決了現有制備中性粒細胞抗原底片的方法中，存在中性粒細胞分布不均勻的問題，從而，當中性粒細胞與抗體反應后，反應結果易觀察，保證了ANCA檢測結果的可靠性。(2)采用0.5g/100g的氯化鈉溶液處理肝素抗凝血，可以保持中性粒細胞生理活性和規則形態，同時加速紅細胞沉淀，30-40min紅細胞即可完全沉淀。(3)采用LymphoprepTM分離液將中性粒細胞分離出來，分離效果明顯，且操作方便，并且采用的是待離心溶液與LymphoprepTM分離液混合后再離心的操作，而非傳統離心管底部放LymphoprepTM分離液，LymphoprepTM分離液上層放待離心溶液，離心時，LymphoprepTM分離液與待離心溶液充分接觸，提高分離效率，增加中性粒細胞層中細胞濃度；本專利技術的制備方法中使用的離心管為特殊結構的離心管，離心管的過濾管內設置有過濾網，并且過濾網的網孔直徑在0.4-0.6μm，當還有多種成分的物質通過該過濾網時，起到分散作用，使不同成分可以均勻的與LymphoprepTM分離液作用，從而增加分離效率；另外，由于這個網孔接近于中性粒細胞的粒徑，使得經過離心，中性粒細胞得以分散，以便于后續制備底片時，細胞具有較好的分散度，保證細胞均勻的分散在載玻片上，便于觀察。此外，使用該離心管后，分離出的中性粒細胞的純度高達95％以上。(4)步驟4中采用緩沖液清洗中性粒細胞層溶液、步驟5中添加氯化鈉溶液，均可以保護中性粒細胞的生理活性不受損失，將中性粒細胞抗原基片對ANCA檢測結果的影響降到最低。附圖說明圖1為本專利技術中離心管的結構示意圖。圖中，1.接收管，2.過濾管，21.過濾網，22.環形限位板，23.蓋子。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術進行詳細說明，但不應理解為本專利技術的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，由于不涉及專利技術點，故不對其步驟進行詳細描述。當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本專利技術另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本專利技術中使用的所有技術和科學術語與本
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本
的技術人員對現有技術的掌握及本專利技術的記載，還可以使用與本專利技術實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本專利技術。本專利技術提供的一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，包括以下步驟：步驟1，將人的肝素抗凝血與0.5g/100g的氯化鈉溶液按照4～6:1的體積比例混合均勻，室溫放置30-40min，直至紅細胞沉淀，吸取上層血漿，備用；需要說明的是，該肝素抗凝血最好采用新鮮的肝素抗凝血。步驟2，將上層血漿加入含有DextranT500(葡聚糖T500)的人淋巴細胞分離液中，充分混勻，然后室溫、3000r/min離心10-15min，吸取沉淀在底部的白細胞層溶液，得到待離心溶液；其中，每100mL人淋巴細胞分離液中添加1.5g的DextranT500，其中，人淋巴細胞分離液購自合肥博美生物科技有限責任公司。步驟3，將所述待離心溶液與LymphoprepTM分離液按1:3～5的體積比例混合后，加入離心管中，將離心管置于水平式離心機內，室溫、1000-2000r/min離心30-35min；離心后中性粒細胞層溶液位于底層血液和LymphoprepTM分離液的界面處，且界面較為明顯；所述LymphoprepTM分離液為挪威Axis-Shield公司生產的LymphoprepTM分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，將人的肝素抗凝血與0.5g/100g的氯化鈉溶液按照4～6:1的體積比例混合均勻，室溫放置，直至紅細胞沉淀，吸取上層血漿，備用；步驟2，將上層血漿加入含有Dextran?T500的人淋巴細胞分離液中，充分混勻，然后室溫、3000r/min離心10?15min，吸取沉淀在底部的白細胞層溶液，得到待離心溶液；其中，每100mL人淋巴細胞分離液中添加1.5g的Dextran?T500；步驟3，將所述待離心溶液與LymphoprepTM分離液按1:3～5的體積比例混合后，加入離心管中，將離心管置于水平式離心機內，室溫、1000?2000r/min離心30?35min；步驟4，吸取中性粒細胞層溶液，加入4℃預冷的緩沖液，4℃、1000r/min離心5?10min，棄上清，收集細胞沉淀；每升所述緩沖液中由以下組分制備而成：5g的氯化鈉、3g的氯化鉀，蒸餾水定容至1L；步驟5，向細胞沉淀中添加4℃預冷的0.8?0.9g/100g氯化鈉溶液，使細胞數為5～5.5×10

【技術特征摘要】
1.一種中性粒細胞抗原底片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，將人的肝素抗凝血與0.5g/100g的氯化鈉溶液按照4～6:1的體積比例混合均勻，室溫放置，直至紅細胞沉淀，吸取上層血漿，備用；步驟2，將上層血漿加入含有DextranT500的人淋巴細胞分離液中，充分混勻，然后室溫、3000r/min離心10-15min，吸取沉淀在底部的白細胞層溶液，得到待離心溶液；其中，每100mL人淋巴細胞分離液中添加1.5g的DextranT500；步驟3，將所述待離心溶液與LymphoprepTM分離液按1:3～5的體積比例混合后，加入離心管中，將離心管置于水平式離心機內，室溫、1000-2000r/min離心30-35min；步驟4，吸取中性粒細胞層溶液，加入4℃預冷的緩沖液，4℃、1000r/min離心5-10min，棄上清，收集細胞沉淀；每升所述緩沖液中由以下組分制備而成：5g的氯化鈉、3g的氯化鉀，蒸餾水定容至1L；步驟5，向細胞沉淀中添加4℃預冷的0.8-0.9g/100g氯化鈉溶液，使細胞數為5～5.5×105mL，得到細胞懸浮液；步驟6，將細胞懸浮液滴加在干凈的載玻片上，自然風干，最后滴加4℃預冷的無水乙醇，固定5-8min，自然風干后...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王婧，劉偉超，
申請(專利權)人：王婧，
類型：發明
國別省市：河南,41