使用HPLC定量測定具體組成肝素或低分子量肝素的方法技術(shù)

分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于通過肝素酶的作用使檢測的樣品解聚，且然后如果合適，還原獲得的解聚物且然后通過高效液相色譜法進(jìn)行分析。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)的實(shí)施方案為檢測分級(jí)分離的肝素或未分級(jí)分離的肝素的樣品中具有1-6脫水結(jié)構(gòu)或乙酰化糖類的成分或?qū)ζ溥M(jìn)行定量的方法。肝素為糖胺聚糖族的生物活性劑，提取自天然來源并且具有抗凝和抗血栓形成特性。它們特別用于治療術(shù)后靜脈血栓形成。為了從肝素源中產(chǎn)生低分子量肝素(LMWH)，必須將較長的肝素多糖鏈打斷成較短的低分子量鏈。這一過程可以通過化學(xué)或酶的解聚來進(jìn)行。結(jié)果可以為約5,000Da的LMWH多糖鏈的平均分子量。LMWHs，如未分級(jí)分離的肝素通過結(jié)合沿多糖鏈中的某些分布的特定戊多糖序列上的ATIII來抑制凝固。每個(gè)經(jīng)批準(zhǔn)的產(chǎn)品的LMWH制造商均使用不同的解聚方法。除非兩個(gè)制造商使用相同的方法，否則這種方法的差別產(chǎn)生具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的LMWHs和由此的不同藥理學(xué)活性和不同的經(jīng)批準(zhǔn)的臨床應(yīng)用適應(yīng)征。所得的LMWHs因用于其制備的解聚方法的不同而在結(jié)構(gòu)上存在差異(R.J.Linhardt等，Seminars in Thombosis and Hemostatis1999；25(3 Supp.)5-16)。結(jié)果是LMWHs比肝素更具有不均勻性。每種不同的方法對(duì)多糖鏈產(chǎn)生了獨(dú)特和高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)修飾。這些修飾包括鏈長和鏈序列以及結(jié)構(gòu)指紋的差異。因此，不同的LMWHs可能具有不同的藥理學(xué)特性和不同的經(jīng)批準(zhǔn)的臨床適應(yīng)征。依諾肝素鈉購自Aventis并且在美國以依諾肝素鈉注射劑形式銷售，商標(biāo)為Lovenox(在某些其它國家中為Clexane)。一般來說，通過對(duì)來源于豬腸粘膜的肝素芐基酯進(jìn)行強(qiáng)堿降解獲得依諾肝素鈉。例如，其結(jié)構(gòu)的特征在于該鏈非還原端上的2-O-磺基-4-烯吡喃糖基糖醛酸基和還原端上的2-N，6-O-二磺基-D-葡糖胺。平均分子量約為4500道爾頓。分子量分布為＜2000道爾頓 ≤20％2000-8000道爾頓≥68％＞8000道爾頓 ≤18％在制備依諾肝素鈉的過程中，存在葡糖胺的6-O-脫硫酸鹽，導(dǎo)致形成稱作“1，6脫水”的衍生物(國際專利申請(qǐng)WO 01/29055)，如下所示 這種類型的衍生物僅對(duì)末端葡糖胺為6-O-硫酸化的寡糖鏈獲得。末端被1，6-脫水鍵修飾的寡糖鏈的百分比為依諾肝素鈉的寡糖混合物的結(jié)構(gòu)特征，并且應(yīng)能夠測定它。基于現(xiàn)有的知識(shí)，依諾肝素鈉中15％-25％的成分在其鏈的還原端上帶有1，6-脫水結(jié)構(gòu)。本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案由此提供了用于分析未分級(jí)分離的肝素和分級(jí)分離的肝素的方法。本文所用的“分級(jí)分離的肝素”指的是任意進(jìn)行解聚的肝素，例如低分子量肝素(LMWH)，包括依諾肝素鈉和正在依據(jù)引證Lovenox/Clexane(依諾肝素鈉注射劑)作為列舉藥物的申請(qǐng)尋求管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的任意LMWH。在一個(gè)實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的分析方法如下通過肝素酶的作用使檢測的樣品解聚，如果合適，然后還原獲得的解聚物，且然后通過高效液相色譜法進(jìn)行分析。如上所述方法由此的特征在于分析解聚物以便檢測末端被1，6-脫水鍵(“1，6-脫水基”)修飾的寡糖鏈的存在。在相關(guān)的實(shí)施方案中，首先使用肝素酶，例如肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)，例如使用各自以0.5個(gè)單位/ml存在的肝素酶的混合物使檢測的樣品完全解聚。(這些酶由Grampian Enzymes集團(tuán)銷售)。本專利技術(shù)的主題由此為用于分析未分級(jí)分離的肝素或分級(jí)分離的肝素的方法，包括下列步驟(a)通過肝素酶的作用使樣品解聚；(b)如果合適，還原解聚物；(c)通過高效液相色譜法分析步驟(a)或(b)的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的主題為如上所述方法，其中肝素酶為肝素酶1(EC 4.2.2.7.)，肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物形式。然后處理由此制備的解聚物以便減少非1，6-脫水形式的還原端(專利申請(qǐng)WO01/72762中所述產(chǎn)品)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用在乙酸鈉中的NaBH4溶液處理解聚物以便減少非1，6-脫水形式的還原端。最終，為了能夠?qū)ο率龅亩穷?和2進(jìn)行定量，可以通過還原劑，諸如，NaBH4的作用還原使用肝素酶解聚的低分子量肝素的樣品。本專利技術(shù)的主題由此為如上所述方法，其中隨后還原解聚的肝素。本專利技術(shù)的主題還在于如上所述方法，其中所述還原劑為NaBH4。還可以使用其它硼氫化物的堿金屬鹽，諸如鋰或鉀鹽。本專利技術(shù)的檢測方法能夠清楚地區(qū)分依諾肝素鈉與其它不含“1，6-脫水”衍生物的低分子量肝素。相反，本專利技術(shù)的方法能夠確定低分子量肝素不具有依諾肝素鈉的物理化學(xué)特征并且由此在性質(zhì)上不同。例如，本專利技術(shù)的方法應(yīng)用于樣品的工序間控制過程中的工業(yè)化方法中，以便提供制備依諾肝素鈉的標(biāo)準(zhǔn)化方法并且獲得均勻批量。在酶解聚和可選的還原端還原后，依諾肝素鈉的1，6-脫水衍生物以4種主要形式存在，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1。本專利技術(shù)的主題由此還在于如上所述方法，其中在解聚反應(yīng)過程中獲得的1，6-脫水殘基包括如下部分 二糖 1二糖 2 二糖 3 四糖 1末端二糖單元上含有1，6-脫水端并且在所述末端二糖的糖醛酸上不帶有2-O-硫酸鹽的寡糖類或多糖類被肝素酶完全解聚并且為二糖1和2的形式。另一方面，當(dāng)末端糖在糖醛酸上含有2-O-硫酸鹽并且當(dāng)它為甘露糖胺形式時(shí)，1，6-脫水衍生物為四糖1形式(耐肝素酶的形式)。三糖1(參見下文)也可以存在于混合物中。它來源于另一個(gè)產(chǎn)生如下結(jié)構(gòu)的降解過程(在依諾肝素鈉的化學(xué)解聚過程中觀察到的剝離現(xiàn)象)。 三糖 1混合物中的其它成分并非是依諾肝素鈉的惟一特征。當(dāng)然存在肝素鏈的8種基本二糖類。這8種基本二糖類特別由Sigma公司銷售。通過本專利技術(shù)的方法鑒定混合物中的其它二糖類二糖ΔIISgal和ΔIVSgal，它們具有作為其來源的-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的堿2-O-脫硫酸化物，從而形成2半乳糖醛酸。它們通常并不存在于肝素的原始結(jié)構(gòu)中(U.M.Desai等，Arch.Biochem.Biophys.，306(2)461-468(1993))。 含有3-O-硫酸化葡糖胺類的寡糖類耐肝素酶裂解并且保持以四糖類的形式存在。就大部分低分子量肝而言，肝素提取自豬粘膜并且這些主要的四糖類以如下形式為代表。這些四糖類耐酶解聚并且反映出對(duì)抗凝血酶III具有親合性的序列。如下標(biāo)記這些四糖類ΔIIa-IIsglu和ΔIIa-IVsglu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，J.Biol.Chem.；270(7)，4780-4787(1993))。 使用肝素酶裂解的混合物中的最終成分為葡糖絲氨酸末端ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.Sugahara等，J.Biol.Chem.；270(39)，22914-22923(1995)；K.Sugahara等；J.Biol.Chem.；267(3)，1528-1533(1992))。后者一般幾乎不存在于依諾肝素鈉中(參見實(shí)施例5中的NMR)。 本專利技術(shù)在另一個(gè)方面中提供了檢測1，6-脫水基團(tuán)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括分離解聚后獲得的各種寡糖類并且可選地用還原劑，諸如本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于對(duì)選自未分級(jí)分離的肝素和分級(jí)分離的肝素的物質(zhì)樣品中成分的量進(jìn)行定量的方法，包括：（ａ）通過酶方法使所述樣品解聚；和（ｂ）通過高效液相色譜法檢測步驟（ａ）的解聚樣品中的成分的量。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：P穆里耶，C維斯科夫，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：艾文蒂斯藥品公司，
類型：發(fā)明
國別省市：FR[法國]