低分子肝素純化方法技術

本發(fā)明專利技術涉及用于抗凝血和抗血栓藥物的低分子肝素的提取純化方法，以粗品低分子肝素為原料，將其溶于ＮａＣｌ溶液，通過分子篩凝膠層析分離截取符合分子量要求的層析液，層析液加入１．０～１．５倍９５％濃度的乙醇，沉淀經脫水、干燥，得低分子肝素片斷。本發(fā)明專利技術采用在層析前用紫外燈照射或加入氧化劑次氯酸鈉或氫溴酸反應的方法除去粗品中有害的－Ｎ－ＮＯ－；采用強陰離子交換樹脂方法除去粗品中苯甲醇等多種化學不純物。本發(fā)明專利技術采用理化手段分離出特定分子量分布的低分子肝素片斷，除去不純物，產品能達到低分子肝素產品國際藥典標準。方法簡單，收率高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及用于抗凝血和抗血栓藥物的低分子肝素的提取純化方法，屬生物醫(yī)藥領域。
技術介紹
肝素應用于臨床抗凝血治療已逾70余年。自上世紀80年代研究發(fā)現，隨著肝素分子量的降低，其抗凝血活性較快地下降，但和抗血栓功能密切相關的抗Xa活性下降相對較慢。基于這一發(fā)現，人們研究出具有較高抗血栓活性-抗Xa活性和較低出血傾向-低抗凝血活性的肝素片斷，即后來應運而生的“低分子肝素”。研究表明，分子量2000以下的肝素片斷沒有抗Xa活性，分子量大于8000的片斷雖有較高的抗Xa活性，但抗IIa活性也較高，使抗Xa/IIa比值太低而不符合低分子肝素鈉的標準。因此藥典規(guī)定，低分子肝素鈉中要求將低于2000和高于8000的部分控制在一定范圍之內。低分子肝素的出現開辟了老藥新用的新篇章。2004年低分子肝素鈉銷售已逾40億美元。特別是安萬特的依諾肝素鈉2004年銷售已逾25億美元。低分子肝素是以不同分子量分布為其特點的生化藥物。不同的分子量分布決定具有不同的抗Xa和抗IIa生物活性。位居全球前四位的制藥巨人均有其特定的低分子肝素鈉，如輝瑞的達肝素鈉分子量在6000左右；葛蘭素的低分子肝素鈣分子量為4300左右；賽諾菲-安萬特的依諾肝素鈉是含有不飽和雙鏈的分子量在4500左右的片斷；諾華的山道低分子肝素鈉是分子量為4500～8000的肝素片斷。低分子肝素的提取工藝有化學降解法、物理降解法、酶降解法等。酶降解法由于生產成本太高而缺乏競爭力。物理降解，如Y-射線因反應難以控制，至今未能大量生產。目前國際市場低分子肝素主流產品均以化學降解方法制得，化學降解法生產的低分子肝素見于四大制藥巨頭。輝瑞從Pharmacia接收了亞硝酸鈉降解的達肝素鈉，葛蘭素從賽諾菲購買的亞硝酸鈉降解的納曲肝素鈣，賽諾菲-安萬特以肝素季銨鹽化→酯化→堿降解的依諾肝素鈉。Opocrin以H2O2-CuCl降解，生產新復先低分子肝素鈉。諾華以亞硝酸異戊酯降解生產的山道低分子肝素鈉。以化學法降解的低分子肝素鈉是分子量從幾百到近一萬的不同分子量片斷的混合物，因此工業(yè)生產上必須采用有效的分離純化手段得到在一定分子量范圍的片段。目前多以分級沉淀進行純化分離，但是分級沉淀技術難以分離出分子量分布狹窄的片斷，如達肝素鈉分子量分布為5600～6400時，分級沉淀難以達到分離效果。為了達到合理的片斷分布，常常使收得率降低。從常規(guī)肝素到低分子肝素的降解過程中需加入氧化劑及各種有機溶劑，如亞硝酸降解中，有硼氫化鈉參與；堿降解法中有季銨鹽、氯化芐、二氯甲烷、甲醇等參與；H2O2法中有銅離子參與。多種化學物參與反應，可能使降解過程中產生一些有害的中間產物和反應副產物，如亞硝酸降解過程中必然會產生對人體有致癌作用的-N-NO-基團，含量一般達1～20ppm，超過歐洲藥典標準0.25ppm的4～80倍；堿降解過程中會產生苯甲醇等，反應結束后還必須去除這些不純物。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種以理化手段從粗品肝素鈉中分離出特定分子量分布的低分子肝素片斷并除去不純物的方法，使低分子肝素質量符合藥典的標準。本專利技術以化學降解所得的粗品低分子肝素為原料，按如下步驟純化①粗品肝素經HPLC測定平均分子量及分子量分布，確定樣品中需要除去部分的百分數；②粗品低分子肝素溶解于1％NaCl(重量)溶液中，制成10～15％(g/ml)粗品肝素鈉溶液，溶液過平衡好的分子篩凝膠層析柱，流速一柱床體積/2小時，以每管等體積(如每管10m1)收集流出的層析液，并按先后序號排列；③逐管測定200nm光吸收值，繪制出光吸收圖譜，根據面積積分及對應步驟①確定的百分數確定需棄去的層析液序號，保留其余序號管內層析液；④合并步驟②保留的各管層析液，加入1.0～1.5倍95％(重量)乙醇，沉淀過夜，棄去上清，沉淀脫水、干燥，得低分子肝素粗品片斷。所說的分子篩層析柱選自Sepharose，Superdex或Sephadex分子篩。一般小分子化合物不純物都可在Superdex×30和SephadexG-50分子篩層析中有效地除去。對于檢得-N-NO-含量超標的粗品肝素，還應選擇以下步驟將步驟②制得的肝素溶液在過分子篩層析柱之前，先用16W波長190～360nm紫外燈照射15～30分鐘。或將步驟②制得的肝素溶液在過分子篩層析柱之前，按低分子肝素重量的0.01～0.1％的量加入氧化劑次氯酸鈉或氫溴酸反應。對于不純物物超標的粗品肝素，本專利技術將步驟②制得的肝素溶液在過分子篩層析柱之前，過陰離子交換樹脂柱，使低分子肝素被樹脂吸附，含不純物的流出液作為廢被棄去，用重量濃度2-5％的NaCl溶液清洗樹脂，去雜質，再用重量濃度12-15％的NaCl溶液從樹脂上洗脫肝素。綜上所述，本專利技術采用分子篩層析技術能得到合理的分子量分布的低分子肝素片斷，并且收得率高于其他傳統(tǒng)的方法。經比較，分子篩層析技術的收率一般要高于分級沉淀5個百分點。對于價格昂貴的生化產品而言，收率的提高對經濟效益的提高是至關重要的。本專利技術選用Sepharose，Superdex，Sephadex等分子篩層析分離取得了較好的結果。Sepharose因具有流速快便于使用。Superdex.因其分離效果好值得推薦。Sephadex因其價格便宜值得選擇。在Sephadex G-50層析時，低分子肝素濃度為10％左右，流速為一個柱床體積/1.5-2小時。對于不純物超標的肝素，本專利技術采用對肝素有特異吸附作用的強陰離子交換樹脂，使低分子肝素被樹脂吸附，不純物留在廢液中被棄去，這一方法可以除去苯甲醇等多種不純物。對于-N-NO-超標的情況，本專利技術采用紫外線照射的物理方法或加入使之產生原子氧的次氯酸或氫溴酸的化學方法打斷-N-NO-鍵。-N-NO-鍵打開后，生成亞硝酸鹽而易于被層析方法除去。經本專利技術方法純化的低分子肝素，其分子分布及不純物含量均能達到低分子肝素產品國際藥典標準。具體實施例方式下面以低分子肝素鈉為例說明低分子肝素的的提取和純化過程。實施例1100g肝素鈉，溶于1000ml 1％NaCl溶液中，調PH2.0～3.0，室溫，加入1.5～3.5％w/w的亞硝酸鈉，最好2.95g亞硝酸鈉，反應2小時，以碘化鉀-淀粉試紙測定不變藍，說明反應完成。調PH9.5，加入1g硼氫化鈉，放置過夜。調PH3.5，一小時后調PH至6.0，加入0.40倍體積乙醇，大分子沉淀析出，將上清吸出，補加95％乙醇至0.70～0.8倍體積，過夜，沉淀脫水、干燥，得粗品55g。HPLC測定樣品分子量分布結果＜2000部分大于20％，＞8000部分符合規(guī)定，熒光化學分析測得-N-NO 8ppm，高于藥典規(guī)定0.25ppm，硼6ppm，高于藥典1ppm，需進行如下純化處理上述粗品溶于550ml 1％(重量)NaCl溶液中，16W波長254nm，紫外燈照射30分鐘。上述照射液過平衡好的Superdex層析柱，層析柱的徑/高為13.5，樣品層為10％柱床體積；流速1.5小時/柱床體積。流出液按每管10ml，依次分管收集。用波長200nm紫外光檢測各管收集液，根據HPLC分子范圍測定結果，棄去序號在先的＜2000的小分子部分，其余部分用1.5倍乙醇沉淀、脫水、干燥得純化低分子肝素鈉產品。產品檢測結果為硼＜1ppm，-N本文檔來自技高網...

【技術保護點】
低分子肝素純化方法，以化學降解所得的粗品低分子肝素為原料，其特征是按如下步驟純化：①粗品肝素經ＨＰＬＣ測定平均分子量及分子量分布，確定樣品中需要應除去的大分子和小分子部分的百分數；②粗品低分子肝素解于重量濃度為１％ＮａＣｌ溶 液中，制成１０～１５％ｇ／ｍｌ粗品肝素溶液，溶液過平衡好的分子篩凝膠層析柱，以每管等體積收集流出的層析液，并按先后序號排列；③逐管測定２００ｎｍ光吸收值，繪制出光吸收圖譜，根據面積積分及對應步驟①確定的百分數確定需棄去的層析液序號， 保留其余序號層析液；④合并步驟②保留的層析液，加入１．０～１．５倍９５％重量濃度的乙醇，沉淀過夜，棄去上清，沉淀脫水、干燥，得低分子肝素片斷。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：唐明龍，
申請(專利權)人：南京健友生物化學制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：84[中國|南京]