一種肝素及其制備方法技術

本發明專利技術為一種肝素及其制備方法，肝素的提取起始原料為腸粘膜，通過酶水解或者鹽水解得到含有肝素的溶液，再通過聚苯乙烯二乙烯苯三甲胺季胺型強堿性陰離子交換樹脂吸附，洗滌，洗脫出肝素類粘多糖物質，本發明專利技術特征是此物質經過精制、純化操作最終得到精品肝素，采用有機溶媒的分級沉淀，從中分離出類肝素類其他粘多糖，如硫酸皮膚素等物質，再經過二次過氧化氫氧化的精制操作。使最終精品肝素質量達到單位效價高，無菌、無熱原、無雜質，透光率、收得率均達到國際國內領先水平，且操作簡便，適合于規模生產。（*該技術在2020年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術公開了，屬一種生物藥品的制備方法。肝素是天然抗凝藥，它的商品有肝素的鈉鹽稱肝素鈉，和肝素的鈣鹽，稱肝素鈣。10mg肝素在4小時內能抑制500ml血漿凝固，臨床上廣泛用于各種外科手術前后防止血栓形成和栓塞，輸血時預防血液凝固和保存鮮血時的抗凝劑，小劑量時用于防治高血脂癥和動脈粥樣硬化。眾所周知，肝素廣泛分布于哺乳動物組織中，如腸粘膜，十二脂腸，肺、肝、胰臟、胎盤及血液中。肝素和大多數粘多糖一樣在體內作為蛋白質結合的復合物存在。這種復合物抗凝活性，而隨著蛋白去除其活性增加。傳統肝素鈉生產工藝，有從牛肺提取，產率低、工藝繁鎖，且最終產品達不到質量要求。另外，從腸粘膜提取有從十六烷三甲基合溴化氨(CTAB)洛合工藝及乙醚用分液漏斗淬取方法，工藝繁鎖，收率少，不宜工業化生產。本專利技術的目的是公開，它具有簡化生產工序，產品質量高并提高工業化生產能力。本專利技術是這樣實現的，在提取工段中，注意到肝素在堿性介質內較為穩定，且堿能打斷肝素與蛋白質的結合，故組織內肝素的提取都采用鈉鹽的堿性熱水或沸水浸提。這樣的提取物內，仍存在可溶性肝素－蛋白質復合物。本專利技術在將粗品肝素內肝素－蛋白質分解有兩類方法(1)酶解技術目前一般在提取時就加入蛋白質水解酶，所使用的酶有細菌蛋白酶，胰蛋白質酶、胰酶、胃蛋白酶和本瓜蛋白水解酶，(2)鹽解技術，鹽解一般是用堿性食鹽水提取與熱變性和凝結劑(明礬、硫酸鋁)等變性措施相結合，以除去蛋白質。上述方法得到的產物仍含有其它粘多糖、核酸及未除盡的蛋白質。本專利技術采用陰離子交換劑或長鏈季銨鹽進行分級分離，再經過有機溶劑分級沉淀和H2O2二次氧化，制得精品肝素。一、酶解樹脂法1、工藝路線 2、工藝過程(按以下次序進行)(1)酶解新鮮腸粘膜(總固體5-7％)，攪拌中加入絞碎的胰臟5-10kg(可用胰酶粉約0．5-1kg)用30-40％氫氧化鈉調pH8．5-9．0左右，升溫至40℃-50℃，保溫2-3小時，pH值應保持在8．5-9．0。加入50公斤粗鹽，升溫至90℃左右，用6N鹽酸調pH6．5左右，停止攪拌，保溫20分鐘，以布袋過濾。(2)離子交換吸附，濾液冷至50℃以下，用6N氫氧化鈉調pH7．0加入50公斤D-254強堿性陰離子交換樹脂，攪拌5小時左右，交換完畢，棄除液體。(3)洗滌與洗脫，用自來水漂洗樹脂至水清。樹脂用2M氯化鈉(約樹脂體積的等量)攪拌洗滌15分鐘，棄去洗滌液，再用1．2M氯化鈉(約樹脂體積的兩倍)同法洗滌2次。用3-5M氯化鈉(約樹脂體積的一半量)洗脫1小時，收集洗脫液，然后用3M氯化鈉(約樹脂體積的三分之一量)同法洗脫2次。合并洗脫液。(4)乙醇沉淀用紙漿助濾，將洗脫液過濾一次，使達澄清。加入體積的0．9倍量95％乙醇，冷處沉淀8-12小時。虹吸上清液棄除，抽濾干或布袋吊濾干后加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥，得肝素粗品。(5)酸化按粗品∶水∶氯化鈉為7∶100∶1，加入純水和氯化物，將粗品投入反應鍋內后開動攪拌，使粗品完全溶解，同時使反應鍋降溫到10℃，用6NHCL，調液體pH1．9，板框壓濾(硅藻土助濾)濾液調pH9．0-11．0。(6)第一次氧化清液恒溫在25℃容器中，緩緩加入2％過氧化氫pH在9-11中保溫24小時，0．2μ微孔濾膜過濾后，0．8倍量95％乙醇沉淀過夜(5-10℃)。(7)第二次氧化虹吸上清廢乙醇，沉淀物加入粗品重量10倍量的1％氯化鈉溶液中充分溶解后，冷卻10℃以下，用0．2μ微孔濾膜過濾后升溫至25℃，用5N氫氯化鈉調pH9-11，加入0．5-1．5％H2O2保溫24小時后再用0．2μ微孔濾膜過濾后，調pH4．0-7．00清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，靜置過夜。(8)6小時后吸去肝素上層酒精清液，粗品重量6-10倍1％無熱原氯化鈉溶液中，溶解后，冷至10℃以下，用0．2μ微孔濾膜再過濾清清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，靜置過夜。(9)次日虹吸廢乙醇后，沉淀物濾干，或吊濾干后用95％乙醇洗滌2-3次。(10)成品進入60-80℃，真空干燥箱，干燥24小時-36小時后進行球磨，粉碎后得精品肝素170-180iu／mg，透光率達英國藥典PB98版標準。二、鹽解樹脂法1、工藝路線 2、工藝過程(按以下次序進行)1)提取取新鮮腸粘膜1000公斤，按3．3％加入食用鹽，用氫氧化鈉調節pH8．8-9．0逐步升溫至50-55℃，保溫2小時，繼續升溫至95℃維持10分鐘，冷卻至60℃以下，用30目雙層布過濾，收集濾液。2)吸附將備用的D-254樹脂按3-5％比例加入攪拌，吸附6小時，停止攪拌，棄除廢液，收集樹脂。用自來水漂洗樹脂洗清為止。3)洗滌與洗脫，將漂洗清的樹脂，倒入缸內，用1．3N氯化鈉溶液為樹脂量的1．5倍體積攪拌洗滌1小時，濾干后再用1．4N氯化鈉溶液洗滌一次，最后樹脂用3N氯化鈉攪拌洗滌2次，第一次為5小時，第二次2小時，第一次的量為樹脂1．5倍，第二次為樹脂的1倍，然后收集洗脫液。4)乙醇沉淀，合并二次濾液，用紙漿助濾，將濾液過濾至澄清，加入體積的1倍量(V／V)95％乙醇沉淀過夜，虹吸上清液棄除，抽濾或者布袋吊濾干后，加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥箱內干燥，得肝素粗品。接下工序按照酶解工藝5-10條辦法進行操作。本專利技術能夠工業化生產中利用酸化后去除酸性雜蛋白再經過的二次過氧化氫氧化技術所獲肝素產品經××××藥品測試產品的單位效價始終保持在每毫克170國際單位以上，而中國藥典、歐洲藥典等都表達在每毫克150國際單位以上。精制的肝素溶解度、澄清度及在紫外光中的吸收度均達到國內外優級產品技術指標；在波長280nm，OD值規定為0．20以下，而本專利技術的產品在0．060-0．080，在波長260nm，OD值規定為0．15以下，而本專利技術產品在0．040-0．050，本專利技術的操作過程中，(不受外因干擾)產品全部達到無菌、無熱原。特別是近年來，國外客商要求產品中的硫酸皮膚素含量必須小于3％以下，而本專利技術生產的肝素，其硫酸皮膚素含量僅在0．5％左右。實施例1一、粗制工段2500千克新鮮腸粘膜投入反應鍋內，在不斷攪拌中加入豬胰酶粉12．5千克，用30-40％氫氧化鈉調pH8．0-8．5，升溫至45℃，保溫2-3小時。加入125千克食鹽，升溫至90℃用6N鹽酸調pH6．5±停止攪拌，保溫20分鐘，以布袋過濾，得清液約3000升，清液用6N氫氧化鈉調pH7．0，LKTY120千克D-254樹脂攪拌，吸附5小時，棄除液體，收集吸附后樹脂，用自來水漂洗清，樹脂用2M氯化鈉攪拌洗滌15分鐘，再用1．2M氯化鈉洗滌2次。洗脫改用5M氯化鈉65知攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用5M氯化鈉40知洗脫半小時，收集濾液與攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用1．2M氯化鈉洗滌2次。洗脫改用5M氯化鈉65升攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用5M氯化鈉40升洗脫半小時，收集濾液與第一次合并約為100升，用布氏漏斗清后加入90升95％乙醇沉淀過夜，次日虹吸上清廢乙醇，沉淀物濾干后用95％乙醇洗1-2遍，進入真空干燥箱60-80℃干燥24小時，得粗品肝素1050克，每毫克效價為102單位。總效價為1．07億單位。二、精制工段1050克粗品加入含1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肝素及其制備方法，肝素提取大多數可從牛肺；哺乳動物的肝臟，胸腺和牛、羊、豬的腸粘膜中提取，通過酶水解，或者鹽水解，用強堿性陰離子交換樹脂分離后得到肝素粗品，酶解生產肝素粗品按以下次序工藝流程進行：腸粘膜在ｐＨ８．５－９．０條件下加入 胰酶和氯化鈉升溫至４０℃－５０℃，保溫２－３小時后升溫到９０℃，用６Ｎ氫氧化鈉調ｐＨ６．５，布袋過濾得清液，加入３－５％的Ｄ２５４樹脂攪拌吸附５小時，樹脂經過洗滌后，洗脫出含肝素的粗品液用１∶０．９倍量９５％乙醇沉淀后，真空干燥得粗品肝素。鹽解生產肝素粗品按以下次序工藝流程進行：腸粘膜加入３．３％食用鹽、氫氧化鈉調ｐＨ８．８－９．０逐步升溫至５０－５５℃，保溫２小時，繼續升溫至９５％，維持１０分鐘冷卻至６０℃，以下用３０目雙層紗布過濾，收集濾液，再加入３－５％的Ｄ２５４樹脂攪拌吸附６小時，棄除廢液，樹脂用水漂洗后，經過洗滌、洗脫，得含肝素液體，加入１倍量９５％乙醇沉淀過夜，虹吸上清（棄除），抽濾或布袋吊濾干后，加９５％乙醇洗２－３次，進６０℃－８０℃真空干燥箱內干燥得肝素粗品，粗品肝素再進行精制和純化，其特征在于：精制純化經過二次過氧化氫的氧化及有機溶媒的分級沉淀，其精制的工藝流程為：粗品溶解于１０－１５倍量１％鹽水中加入６Ｎ鹽酸調ｐＨ１．０－２．０，在５℃－１０℃條件下過濾出清液，調ｐＨ９．０－１１．０加入０．５－１．５％Ｈ↓［２］Ｏ↓［２ ］升溫２５℃并保溫２４小時后，用０．２μ的微孔濾膜過濾后，０．８倍量９５％酒精沉淀６小時后，虹吸出上清，沉淀物用１％氯化鈉鹽水溶解后再調ｐＨ９．０－１１．０再加入１．５％Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］升溫２５℃，并保溫２４小時后，用０．２μ的微孔濾膜過濾后，０．７倍量９５％酒精沉淀６小時后，虹吸出上清，沉淀溶解于粗品重量６－１０倍的１％無熱原氯化鈉溶解中，冷至１０℃以下，用０．２μ微孔濾膜再將液體濾至澄清，清液加入０．７倍量９５％酒精沉淀靜止過夜，次日吸出上清液，沉淀濾干后，９５％乙醇洗滌１－２次后進６０℃－８０℃真空干燥箱，干燥２４－３６小時后，球磨后得精品肝素。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：沙龍華，金武，
申請(專利權)人：上?；莺Ｉ破窂S，
類型：發明
國別省市：31[中國|上海]