一種檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒，屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合，其包括SEQ?ID?NO.1?2所示的下游引物中的一種或兩種、SEQ?ID?NO.3所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.4所示的捕獲探針，下游引物的5’端或上游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。該核酸組合可針對(duì)MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，其具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作便捷等特點(diǎn)。

Nucleic acid combination for detecting MTHFR gene mutation and its application and reagent kit

The invention discloses a nucleic acid combination for detecting MTHFR gene mutation, an application and a kit thereof, belonging to the technical field of gene detection. The combination of the nucleic acid detection of MTHFR gene mutation and its downstream primers including SEQ ID NO.1 2 shown in one or two, SEQ ID represented by NO.3 and SEQ ID upstream primer NO.4 shows a capture probe, downstream primer 5 'end or upstream primer 5' end labeled with affinity for binding catalytic enzyme. The nucleic acid combination can detect the C677T mutation site of the MTHFR gene, and has the advantages of high sensitivity, strong specificity, low cost, convenient operation, etc..

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因檢測(cè)
，具體而言，涉及一種檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合及其應(yīng)用和試劑盒。
技術(shù)介紹
MTHFR(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase)全稱為5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，是葉酸和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶。位于第一號(hào)染色體1p36.3位置。MTHFR全長(zhǎng)19.3kb，共有外顯子12個(gè)，mRNA全長(zhǎng)7,105bp，編碼657個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，它的主要生化功能是催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸。MTHFR基因主要存在兩種多態(tài)類型，分別為常見的C677Trs1801133、A1298Crs1801131，另外葉酸代謝循環(huán)上還有MTRR基因的A66Grs1801394位點(diǎn)。但實(shí)際上只有677位點(diǎn)的多態(tài)性與疾病及藥物代謝的的關(guān)系是被公認(rèn)的，并且被寫入《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄(2013年版)》中，該目錄沒有包括其他2個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)，研究認(rèn)為，以上位點(diǎn)多態(tài)性與多種疾病相關(guān)。葉酸在細(xì)胞功能、分裂和分化中起著重要的作用，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)能夠參與葉酸代謝通路，催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之參與同型半胱氨酸通路，為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，進(jìn)一步形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，對(duì)維持細(xì)胞正常周期和細(xì)胞活性有著重要的作用。如果這兩種途徑所涉及到的酶發(fā)生缺陷或缺失，將導(dǎo)致通路的阻塞，使血液中的同型半胱氨酸的濃度增加，對(duì)血管壁產(chǎn)生損傷。同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)換就會(huì)發(fā)生障礙，相繼引發(fā)出一系列病理變化：(1)同型半胱氨酸堆積，導(dǎo)致甲基化作用的減弱，這就直接影響50多種重要物質(zhì)的合成；(2)高濃度的同型半胱氨酸能損害血管的內(nèi)皮細(xì)胞，成為重要的心腦血管致病因素；(3)高濃度的同型半胱氨酸作用于敏感的胚胎神經(jīng)細(xì)胞，可造成無腦畸形和脊柱裂等不可逆損害；(4)同型半胱氨酸溶解性小，易于在泌尿系統(tǒng)形成結(jié)石。在MTHRF基因多態(tài)性與出生缺陷關(guān)系的研究中，幾乎所有的焦點(diǎn)都集中于神經(jīng)管缺陷(NTD)，盡管MTHRF基因突變頻率在不同國(guó)家和民族分布不同，但來自不同地區(qū)的大量研究均證實(shí)母親MTHRFC677T突變是生育神經(jīng)管缺陷患兒的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。一項(xiàng)分別對(duì)母親、胎兒及父親的MTHRFC677T突變研究表明，母親677C/T純合突變使出生神經(jīng)管缺陷嬰兒的風(fēng)險(xiǎn)升高2倍，胎兒677T/T純合突變使NTD風(fēng)險(xiǎn)升高1.6倍。與MTHRF基因多態(tài)性關(guān)系密切的另一種出生缺陷是唐氏綜合征。資料顯示唐氏綜合征患者的第3條21號(hào)染色體93％是母源性的，因此母親的基因或代謝異常是發(fā)生唐氏綜合征的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。近年來的許多研究表明母親MTHRF基因突變可導(dǎo)致MTHRF活性降低，使作為甲基間接工體的5-甲基四氫葉酸生成障礙，從而導(dǎo)致DNA的低甲基化和染色體異常。此外，MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。妊娠相關(guān)疾病包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、胎盤早剝、妊娠高血壓綜合征等。MTHFR基因C677T突變導(dǎo)致MTHFR血酶活力降低，引起血漿同型半胱氨酸濃度增加，妊娠期高同型半胱氨酸血癥可導(dǎo)致血液呈高凝狀態(tài)，增加胎盤血栓形成的危險(xiǎn)，引起胎盤栓塞，造成母胎循環(huán)不足，從而可導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限和胎盤早剝；另一方面，高同型半胱氨酸血癥可在金屬離子介導(dǎo)下自身氧化生成過氧化物及氧自由基，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能并進(jìn)一步導(dǎo)致患者血管舒縮因子平衡紊亂，從而引發(fā)妊高征。另外由于胎盤組織中MTHFR活力缺乏，致使作為甲基間接供體的5-甲基四氫葉酸生成障礙，進(jìn)一步影響嘌呤、嘧啶和核酸的代謝及DNA甲基化，使得胎兒發(fā)育必需的生物成分包括DNA和蛋白質(zhì)的甲基化不足，也是引起流產(chǎn)或使胎兒生長(zhǎng)受限的原因之一。MTHFR基因的C677T純合突變，導(dǎo)致酶的活性只有野生型的30％；雜合突變，酶的活性是野生型的70％。在中國(guó)人群中，野生型基因比例為27％，而雜合突變的比例為44％，純合突變的比例為29％。對(duì)于MTHFR的C677T基因檢測(cè)，可以及早發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體對(duì)葉酸的吸收水平，從而篩查出容易引起葉酸缺乏的高危人群，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化增補(bǔ)葉酸，同時(shí)加強(qiáng)產(chǎn)前檢查，以降低新生兒出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)。目前，用于MTHFR基因分型的方法有以下幾種，各有其特點(diǎn)。1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)PCR-RFLP為最為經(jīng)典的SNP分型方法，它先利用PCR擴(kuò)增跨越多態(tài)位點(diǎn)的靶DNA，然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，最后根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳條帶判斷基因型。PCR-RFLP分型法操作簡(jiǎn)單，所需模板DNA量少，無需使用大型貴重儀器，實(shí)驗(yàn)中不涉及危險(xiǎn)試劑，安全性高。但該法的一個(gè)最大缺點(diǎn)在于，會(huì)因?yàn)閮?nèi)切酶的活性、酶切時(shí)間、酶切體系的不恰當(dāng)?shù)仍蛟斐杉訇幮曰蚣訇?yáng)性而出現(xiàn)基因型的誤判。2.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)AS-PCR的基本原理是根據(jù)SNP位點(diǎn)的堿基特點(diǎn)設(shè)計(jì)2條等位基因特異引物(針對(duì)于野生型等位基因的P1、針對(duì)突變型等位基因的P2)，它們的3’末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同)，另需一條按常規(guī)方法設(shè)計(jì)的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有擴(kuò)增產(chǎn)物，在突變型等位基因中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，用P2、P3作引物，情況則剛好相反。PCR結(jié)束后，用凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步驟更簡(jiǎn)潔，但是等位基因特異性PCR擴(kuò)增方法的假陽(yáng)性率較高，其對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格。3.Taqman探針技術(shù)Taqman探針技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上增加熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR產(chǎn)物的不斷增加，熒光的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，則可以檢測(cè)到一個(gè)熒光增長(zhǎng)曲線。該法的主要不足是采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，其定量檢測(cè)受酶活性的影響；本底較強(qiáng)，有時(shí)無法鑒別高度相關(guān)序列；探針標(biāo)記以及實(shí)驗(yàn)儀器成本較高，不便普及應(yīng)用。4.高分辨率熔解曲線法高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(highresolutionmelting，HRM)是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它在PCR體系中加入飽和雙鏈DNA結(jié)合染料，在PCR結(jié)束后制作高分辨率熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的不同來對(duì)樣品進(jìn)行分型。該方法因其快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。但HRM技術(shù)對(duì)儀器溫度的均一性要求非常高，需LightCycleryTM480PCR儀或LightScanner等價(jià)格高昂的專用儀器及精密的分析軟件。另外，該法要求擴(kuò)增片段的大小在400bp以下，引物設(shè)計(jì)受到局限，PCR條件的優(yōu)化比較復(fù)雜。5.直接測(cè)序法。測(cè)序法是檢測(cè)SNP的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高。包括直接測(cè)序(雙脫氧鏈終止法)、焦磷酸測(cè)序及微測(cè)序等。測(cè)序需要一些特殊的儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，費(fèi)用高，周期長(zhǎng)；對(duì)PCR產(chǎn)物的量、純度及特異性要求高，PCR后操作步驟繁瑣。測(cè)序法目前在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用還是有一定的困難，多作為其他分析方法的確認(rèn)。6.變性高效液相色譜法。該方法的原理基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異，利用色譜方法進(jìn)行分離。由于雜合雙鏈本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合，其特征在于，其包括SEQ?ID?NO.1?2所示的下游引物中的一種或兩種、SEQ?ID?NO.3所示的上游引物以及SEQ?ID?NO.4所示的捕獲探針，所述下游引物的5’端或所述上游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合，其特征在于，其包括SEQIDNO.1-2所示的下游引物中的一種或兩種、SEQIDNO.3所示的上游引物以及SEQIDNO.4所示的捕獲探針，所述下游引物的5’端或所述上游引物的5’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合，其特征在于，所述親和物為地高辛、異硫氰酸熒光素和生物素中的任意一種。3.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合在制備用于檢測(cè)MTHFR基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。4.一種試劑盒，其特征在于，其包括權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)MTHFR基因突變的核酸組合。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于將所述核酸組合的所述捕獲探針固定至檢測(cè)孔板的固定物，所述固定物包括導(dǎo)電聚合物和離子化合物；所述導(dǎo)電聚合物為選自吡咯、苯胺和噻吩中的任意一種；所述離子化合物為選自氯化鈉和氯化鉀中的任意一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：廖瑋，莫亞勤，林曉燕，張晨光，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京易活生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11