一種sgRNA及其構(gòu)建的慢病毒載體和應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種sgRNA及其構(gòu)建的慢病毒載體和應(yīng)用，具體為以SIVmac1A11慢病毒為骨架，表達(dá)SpCas9蛋白及基因特異性的sgRNA，用于治療人和猴艾滋病。所述sgRNA的核酸序列如SEQ?ID?NO.1?2所示。本發(fā)明專利技術(shù)采用了目前最高效的CRISPR/Cas9基因編輯工具，所設(shè)計(jì)的CXCR4/CCR5基因sgRNA位點(diǎn)具有優(yōu)于以往研究所報(bào)道的其他位點(diǎn)的基因敲除活性，也是首次應(yīng)用于SIV感染恒河猴的基因治療，相比ZFN和TALEN具有操作便捷、成本低廉等優(yōu)勢。

SgRNA and slow virus carrier constructed and application thereof

The present invention relates to the field of gene therapy, especially the lentiviral vector and the application relates to a sgRNA and its construction, specifically to SIVmac1A11 lentivirus skeleton, the expression of SpCas9 protein and gene specific sgRNA, for the treatment of human and simian aids. The nucleic acid sequence of the sgRNA 2 is shown as SEQ ID NO.1. The invention adopts the CRISPR/Cas9 gene at the most efficient editing tools, the CXCR4/CCR5 gene sgRNA site design is better than the previous studies of other sites reported by gene knockout activity, is also the first application in gene therapy of SIV infection in monkeys in Ganges RIver, compared with ZFN and TALEN has the advantages of low cost, convenient operation.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種sgRNA及其構(gòu)建的慢病毒載體和應(yīng)用，具體為以SIVmac1A11慢病毒為骨架，表達(dá)SpCas9蛋白及基因特異性的sgRNA，用于治療人和猴艾滋病。
技術(shù)介紹
成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)的Cas9蛋白系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)是細(xì)菌和古細(xì)菌用于抵御外源病毒感染的天然防御機(jī)制。外源的DNA入侵細(xì)菌/古細(xì)菌后，會(huì)被細(xì)胞中與外源DNA特定區(qū)域互補(bǔ)的RNA引導(dǎo)序列(guideRNA)識別，并引導(dǎo)Cas9核酸酶到達(dá)識別部位，對目標(biāo)序列進(jìn)行酶切，從而降解外源DNA。此系統(tǒng)具體工作原理如下：crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activatingRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，該復(fù)合物能夠引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的目標(biāo)序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。通過人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的單鏈sgRNA(singleguideRNA)，引導(dǎo)Cas9對DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。作為一種RNA導(dǎo)向的雙鏈DNA結(jié)合蛋白，Cas9效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個(gè)統(tǒng)一因子(unifyingfactor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)膕gRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可連接到目標(biāo)DNA，不影響Cas9的結(jié)合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列處帶來任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。因此CRISPR/Cas9很快作為新的基因編輯工具被廣泛應(yīng)用于遺傳工程、作物育種以及基因治療等領(lǐng)域。艾滋病是一種難以根治的慢性傳染病。盡管聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以控制HIV-1病毒的復(fù)制，維持患者的生存，但是藥物的副作用以及長期用藥產(chǎn)生的抗藥性等問題仍然存在，尋找更有效，且能改善患者生存質(zhì)量的治療策略是艾滋病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。艾滋病的基因治療已涉及到病毒感染宿主的整個(gè)生命周期，其中靶向病毒入侵門戶——輔助受體CXCR4和CCR5的治療策略已經(jīng)在臨床上展現(xiàn)了曙光。2007年一位感染HIV-1且身患急性髓細(xì)胞性白血病的男子，經(jīng)過異體移植CCR5基因天然缺失32個(gè)堿基(CCR5Δ32/Δ32)的供者骨髓后，至今仍未檢測到體內(nèi)病毒的反彈，且身體狀況良好，被公認(rèn)是全球第一例被治愈的艾滋病患者。后續(xù)的研究表明，表型的供者骨髓是實(shí)現(xiàn)根治的關(guān)鍵。然而天然攜帶CCR5Δ32/Δ32基因型的人數(shù)稀少，且存在HLA配型等問題，限制了此療法的推廣。此外，已有大量研究證實(shí)，HIV-1不同的毒株具有不同的共受體嗜性(CCR5嗜性，CXCR4嗜性，X4-R5雙嗜性等)，并且同一個(gè)患者體內(nèi)也存在不同嗜性的HIV-1變異體。因此利用遺傳工具來修飾患者自身CCR5、CXCR4等基因，并自體回輸，用于控制和治療HIV-1感染，有可能最終實(shí)現(xiàn)功能性治愈。CN104480144A公開了一種可用于艾滋病基因治療的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體及其慢病毒，該重組慢病毒載體由慢病毒載體lentiCRISPR用BsmBI酶切后，連入帶BsmBI粘性末端的CXCR4特異靶序列重組而得。其采用的是人的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體，其安全性不高。恒河猴作為艾滋病研究的模型，具有小鼠所不具有的優(yōu)勢：首先猴與人的遺傳背景更為接近；其次，研究已證實(shí)HIV-1起源于SIV，HIV-1感染人的病程和病理特征與SIV感染恒河猴十分相似。因此，用恒河猴感染SIVmac251作為慢性感染模型，對于臨床治療HIV-1感染具有重要的參考意義。以往的研究中，利用鋅指核酸酶(ZFN)或轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)對獼猴的胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因的特異性修飾，用于獲得轉(zhuǎn)基因猴，但是對于分化的外周原代細(xì)胞的基因修飾，所能運(yùn)用的技術(shù)手段有限。利用腺病毒或者腺相關(guān)病毒作為載體傳遞ZFN或TALEN能夠?qū)ν庵苎?xì)胞進(jìn)行適度的修飾，但是這兩種技術(shù)的運(yùn)用較為復(fù)雜，而腺病毒本身對恒河猴有免疫原性，可能會(huì)影響基因修飾的效果。因此采用SIV慢病毒載體，傳遞CRISPR/Cas9，既能提高感染原代細(xì)胞的效率，同時(shí)也能更為方便快捷高效地對目的基因進(jìn)行修飾，提高基因修飾的安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對目前的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體，由于人是HIV-1的天然宿主，以HIV-1為載體的慢病毒對人有潛在的安全隱患，并且對非人靈長類原代細(xì)胞尤其是T細(xì)胞感染效率很低，本專利技術(shù)提供一種sgRNA及其構(gòu)建的慢病毒載體和應(yīng)用，經(jīng)過CXCR4和CCR5雙基因修飾的猴T細(xì)胞在體外的SIV病毒感染試驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)于野生型細(xì)胞的抗病毒侵染能力。為達(dá)此目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：第一方面，本專利技術(shù)提供一種sgRNA，所述sgRNA的核酸序列如SEQIDNO.1-3所示。所述核酸序列如下：SEQIDNO.1：CTACAGCAGTGTCCTCATCCTGG；SEQIDNO.2：CAATGTGTCAACTCTTGACAGGG；本專利技術(shù)中，所述sgRNA可根據(jù)敲除基因的需要進(jìn)行選擇，只需敲除CXCR4選擇SEQIDNO.1所示的sgRNA，只需敲除CCR5選擇SEQIDNO.2所示的sgRNA，若需要同時(shí)敲除CXCR4和CCR5，可分別將SEQIDNO.1和SEQIDNO.2與啟動(dòng)子連接，共同導(dǎo)入同一個(gè)質(zhì)粒中，實(shí)現(xiàn)同時(shí)敲除。優(yōu)選地，所述sgRNA的啟動(dòng)子為U6啟動(dòng)子。本專利技術(shù)中，選擇SIVmac251感染的中國恒河猴，在病毒感染的慢性期采集患猴的自身細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞(HSC)、外周血CD4+T細(xì)胞并體外短期培養(yǎng)擴(kuò)增，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Cas9核酸酶以及靶向CXCR4和/或CCR5基因的sgRNAs的慢病毒載體。由于人是HIV-1的天然宿主，以HIV-1為載體的慢病毒對人有潛在的安全隱患，并且對非人靈長類原代細(xì)胞尤其是T細(xì)胞感染效率很低，因此選擇基于猴免疫缺陷病毒SIVmac1A11的第3代慢病毒骨架，最終獲得的慢病毒命名為SIV-CRISPR/Cas9，將SIV-CRISPR/Cas9慢病毒體外感染原代細(xì)胞，隨后將基因修飾的細(xì)胞回輸給經(jīng)過條件性處理的患猴，觀察治療效果。第二方面，本專利技術(shù)提供一種SIV-CRISP/cas9慢病毒載體，所述慢病毒載體包含如第一方面所述的sgRNA的核酸序列。第三方面，本專利技術(shù)提供一種如第二方面所述的SIV-CRISP/Spcas9慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：(1)使用HpaI和ClaI雙酶切pCL20cSLFRMSCV-GFP載體，得到酶切后的載體；(2)PCR擴(kuò)增U6啟動(dòng)子-sgRNA-EFS啟動(dòng)子-Cas9序列，通過末端重組的方式克隆到步驟(1)酶切后的載體上，得到所述SIV-CRISP/Spcas9慢病毒載體。優(yōu)選地，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的引物的核酸序列如SEQIDNO.3-4所示。所述核酸序列如下：SEQIDNO.3：CGGTGGTTCGAACGCGTTAACCCTATTTCCCATGATTCCTTC；SEQIDNO.4：GGTACCGTATACGGCATCGATGTAATCCAGAG本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列如SEQ?ID?NO.1?2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的啟動(dòng)子為U6啟動(dòng)子。3.一種SIV-CRISP/cas9慢病毒載體，其特征在于，所述慢病毒載體包含如權(quán)利要求1或2所述的sgRNA的核酸序列。4.一種如權(quán)利要求3所述的SIV-CRISP/Spcas9慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)使用HpaI和ClaI雙酶切pCL20cSLFRMSCV-GFP載體，得到酶切后的載體；(2)PCR擴(kuò)增U6啟動(dòng)子-sgRNA-EFS啟動(dòng)子-Cas9序列，通過末端重組的方式克隆到步驟(1)酶切后的載體上，得到所述SIV-CRISP/Spcas9慢病毒載體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，步...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：姚永超，陳小平，余松林，肖宏奎，李姣姣，秦莉，趙思婷，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44