一種以葉片為外植體的紅椿再生方法技術

本發明專利技術公開了一種以葉片為外植體的紅椿再生方法。本發明專利技術的以葉片為外植體的高效組織培養和植株再生方法，可擺脫外界條件的影響，規模化和工廠化生產出健壯、整齊一致的紅椿組培幼苗；與已經報道的以紅椿大樹莖段作為外植體構建再生體系相比，具有操作方便、取材廣泛、可重復性強及效率高等優勢。該方法可滿足市場對種苗的需求，為紅椿種質資源可持續利用奠定基礎。

A leaf explants of six regeneration method

The invention discloses a leaf explants of six regeneration method. The invention of the leaf for culture and plant regeneration, tissue explants, can get rid of external conditions, scale and factory to produce robust, uniform t.ciliata tissue culture seedlings has been reported; and on toon tree stems as explants to build the regeneration system, has the advantages of convenient operation, wide, strong repeatability and high efficiency advantages. This method can meet the market demand of the seedlings, and lay the foundation for the sustainable utilization of six germplasm resources.

【技術實現步驟摘要】
一種以葉片為外植體的紅椿再生方法
本專利技術屬于植物組織培養
，具體涉及一種以葉片為外植體的紅椿再生方法。
技術介紹
紅椿(ToonaciliataRoem.)，又名紅楝子，隸屬楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)。在我國，紅椿主要分布在華南、華中、華東及西南地區，天然居群具有零星分布特點，印度、老撾、緬甸、巴基斯坦、澳大利亞東海岸也有分布。紅椿材質好，素有“中國桃花心木”之稱，是優良的家具用材。它具有早期速生性狀明顯、生長快等特點，生長量均超過一般人工栽培的常綠闊葉樹種，在我國南方地區已成為重點開發利用的優質速生用材樹種。由于環境的變化、天然更新能力較差及過度的采伐破壞，紅椿目前已成為瀕危樹種，是1999年經國務院批準的國家Ⅱ級重點保護野生植物，并列入《中國主要栽培珍貴樹種參考名錄》。紅椿材質細密，紋理通直，花紋美麗，芯材呈深紅褐色，被廣泛應用在家具設計、車船制造及室內裝飾領域；其樹形美觀，也可以作為行道樹栽種。目前紅椿的研究主要側重于引種、繁育等常規育種。其繁殖方式多采用種子繁殖，但由于種子的保存能力有限，子代家系并不能完全保存親代優良的遺傳性狀，故紅椿的扦插、嫁接及組織培養技術得到越來越多的關注。扦插及嫁接繁殖對紅椿的嫩枝要求較高，采穗圃的構建同樣需要大量人力物力。在短時間內，傳統的種子繁殖和扦插繁殖不能及時滿足種苗市場需求，此時，可通過組織培養技術解決種苗快速且大量繁殖問題。此外，構建成熟高效的再生體系是遺傳轉化成功的基礎，并為轉入目的基因獲得更加優質的紅椿品種奠定基礎，有效解決紅椿幼樹致命蟲害等諸多問題，高效推進紅椿的定向遺傳改良。國外紅椿組織培養技術研究報道較少，主要從成年大樹上采集外植體進行離體繁殖，所獲得的腋芽誘導率均較低，且生根培養并不成功。國內紅椿組織培養主要以種子及成年大樹帶芽莖段作為外植體建立組培體系，但增殖情況并不理想。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種以紅椿葉片為外植體的操作更簡便、取材更廣泛的高效的紅椿再生方法，利用該方法能夠在短期內快速獲得大量優質的紅椿種苗。本專利技術以紅椿葉片為材料，獲得健康的愈傷組織，系統研究紅椿的再生體系，旨在解決葉片再生問題，提高紅椿再生能力，為工廠化生產種苗、種質資源保護和基因工程研究提供有效的參考價值。本專利技術的以葉片為外植體的紅椿再生方法，其特征在于，包括以下步驟：A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側翅，在水中浸泡3～5h，經消毒后將種子播種于固體MS培養基上培養得到無菌苗，切取無菌苗的小葉作為外植體；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；B、芽的誘導及伸長：將小葉接種到芽誘導培養基上培養誘導愈傷組織，接種時小葉遠軸面朝上；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；培養至外植體上分化出芽點時，將長芽的外植體轉移到芽伸長培養基上在相同培養條件下培養誘導不定芽伸長；所述的芽誘導培養基：每升含有6-BA1.8～3.2mg、KT0.5～1.5mg、NAA0.03～0.15mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；所述的芽伸長培養基：每升含有6-BA0.05～0.3mg、NAA0.1～0.3mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；C、生根培養：待不定芽伸長到3～5cm時，切取不定芽，接種于生根培養基上培養誘導生根，得到生根苗；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；所述的生根培養基：每升含有NAA0.1～0.3mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；D、煉苗及移栽：將生根苗煉苗后從培養瓶中挖出，洗凈根上的培養基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到泥炭土上，進行栽培管理，得到紅椿植株。優選，所述的步驟A的消毒是將紅椿種子用體積分數75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質量分數10％次氯酸鈉水溶液滅菌15～20min，無菌水沖洗3～5次。優選，所述的步驟D的煉苗是打開培養瓶蓋讓生根苗適應2d。優選，所述的步驟D的泥炭土是高溫滅菌過的泥炭土。所述的步驟A的固體MS培養基：每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0。所述的MS培養基為國際通用的培養基，其成份和配置方法見MurashigeT,SkoogF(1962)Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassaywithtobaccotissuecultures.PhysiolPlant15:473–497。本專利技術的以葉片為外植體的紅椿高效組織培養和植株再生方法，可擺脫外界條件的影響，規模化和工廠化生產出健壯、整齊一致的紅椿組培幼苗；與已經報道的以紅椿大樹莖段作為外植體構建再生體系相比，具有操作方便、取材廣泛、可重復性強及效率高等優勢。該方法可滿足市場對種苗的需求，為紅椿種質資源可持續利用奠定基礎。附圖說明圖1為種子培養35d得到的無菌苗，用于切取葉片。圖2為芽誘導培養基上培養30d的小葉外植體上的芽點。圖3為在芽伸長培養基上培養30d伸長的不定芽。圖4為不定芽在生根培養基上培養30d后誘導出的根。圖5為移栽成活的紅椿植株。具體實施方式以下實施例是對本專利技術的進一步說明，而不是對本專利技術的限制。實施例1A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側翅，在水中浸泡4h；在無菌超凈臺上，用體積分數75％乙醇水溶液滅菌1min，無菌水沖洗1次，質量分數10％次氯酸鈉水溶液滅菌18min，無菌水徹底沖洗4次，然后將種子播種于固體MS培養基上培養，培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d。種子培養3d左右開始萌芽，35d后，無菌苗(如圖1所示)復葉長出，切取其上的單個小葉作為外植體。所述固體MS培養基每升含有蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調pH，然后滅菌備用。B、芽的誘導及伸長：將小葉接種到芽誘導培養基上培養誘導愈傷組織，接種時小葉遠軸面朝上；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d。外植體上開始有愈傷出現，在培養30d后，逐漸分化為芽點(如圖2所示)，將長芽的外植體轉移到芽伸長培養基上在相同培養條件下培養誘導不定芽伸長。培養30d后伸長的不定芽如圖3所示。所述的芽誘導培養基：每升含有6-BA2.5mg、KT1.0mg、NAA0.1mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調pH，然后滅菌備用。所述的芽伸長培養基：每升含有6-BA0.15mg、NAA0.2mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調pH，然后滅菌備用。C、生根培養：待不定芽伸長到4cm時，切取不定芽，接種于生根培養基上培養誘導生根，培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d。生根培養30d后，不定芽長出多條根得到生根苗，生根情況如圖4所示。所述的生根培養基：每升含有NAA0.2mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8；配制方法是將上述成份混合均勻，調pH，然后滅菌備用。D、煉苗及移栽：打開培養瓶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種以葉片為外植體的紅椿再生方法，其特征在于，包括以下步驟：A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側翅，在水中浸泡3～5h，經消毒后將種子播種于固體MS培養基上培養得到無菌苗，切取無菌苗的小葉作為外植體；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；B、芽的誘導及伸長：將小葉接種到芽誘導培養基上培養誘導愈傷組織，接種時小葉遠軸面朝上；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；培養至外植體上分化出芽點時，將長芽的外植體轉移到芽伸長培養基上在相同培養條件下培養誘導不定芽伸長；所述的芽誘導培養基：每升含有6?BA?1.8～3.2mg、KT?0.5～1.5mg、NAA?0.03～0.15mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH?5.8～6.0；所述的芽伸長培養基：每升含有6?BA0.05～0.3mg、NAA?0.1～0.3mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH?5.8～6.0；C、生根培養：待不定芽伸長到3～5cm時，切取不定芽，接種于生根培養基上培養誘導生根，得到生根苗；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；所述的生根培養基：每升含有NAA0.1～0.3mg、蔗糖15g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；D、煉苗及移栽：將生根苗煉苗后從培養瓶中挖出，洗凈根上的培養基，將生根苗在自來水中浸泡1h，移栽到泥炭土上，進行栽培管理，得到紅椿植株。...

【技術特征摘要】
1.一種以葉片為外植體的紅椿再生方法，其特征在于，包括以下步驟：A、外植體的獲得：將紅椿種子去掉雙側翅，在水中浸泡3～5h，經消毒后將種子播種于固體MS培養基上培養得到無菌苗，切取無菌苗的小葉作為外植體；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；B、芽的誘導及伸長：將小葉接種到芽誘導培養基上培養誘導愈傷組織，接種時小葉遠軸面朝上；培養條件為溫度25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d；培養至外植體上分化出芽點時，將長芽的外植體轉移到芽伸長培養基上在相同培養條件下培養誘導不定芽伸長；所述的芽誘導培養基：每升含有6-BA1.8～3.2mg、KT0.5～1.5mg、NAA0.03～0.15mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；所述的芽伸長培養基：每升含有6-BA0.05～0.3mg、NAA0.1～0.3mg、蔗糖30g和瓊脂5g，余量為MS培養基，pH5.8～6.0；C、生根培養：待不定芽伸長到3～5cm時，切...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李培，陳曉陽，商園園，李俊成，張俊杰，周瑋，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：廣東,44