本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽。本發(fā)明專利技術(shù)的茶樹幼胚抑菌組培過程中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了茶樹幼胚組培技術(shù)環(huán)節(jié)，降低了茶樹幼胚組培成本；而且操作簡單，只需按不同的培養(yǎng)基配方配制后即可使用，實用性強，推廣性好。本發(fā)明專利技術(shù)的茶樹幼胚抑菌組培方法與常規(guī)的茶樹幼胚組培方法相比，可以降低成本10％以上。
Tissue culture method for culturing young embryo of tea tree by using bacteriostatic culture medium
The invention relates to a method for cultivating tea embryo culture medium by tissue culture methods including antibacterial, culture medium preparation, disinfection container, sterile water preparation, induction, differentiation culture, rooting and seedling transplant. The tea plant embryo inhibition during tissue culture, culture medium and container without autoclaving, reducing the workload and energy consumption, simplifies the tea embryo tissue culture technology link, reduces the cost of tissue culture of immature embryo of tea; and the operation is simple, only according to the different culture medium can be used after preparation. Strong practicability, good generalization. Compared with conventional tissue culture method for young embryo of tea tree, the invention can reduce the cost by more than 10%.
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法
本專利技術(shù)涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法，屬生物
技術(shù)介紹
茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)為山茶科山茶屬多年生常綠喬木或灌木，具有悠久的栽培歷史，是我國重要的經(jīng)濟作物之一。常規(guī)茶樹育種技術(shù)具有局限性，如遠(yuǎn)緣雜交困難，有益突變頻率低、選育優(yōu)良品種耗時長、花期不遇等，制約了茶樹優(yōu)質(zhì)資源的利用，使得茶樹品種選育工作難以取得突破性的進展雖然傳統(tǒng)育種方法已培育出了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的茶樹品種，但生產(chǎn)上仍缺少高茶氨酸、高茶多酚和低咖啡堿等符合人們消費需求的特異品種。這主要是因為茶樹基因的高度雜合性，傳統(tǒng)的茶樹育種年限長、難度較大。植物離體再生技術(shù)的日益成熟和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，為茶樹品種創(chuàng)新開辟了新的途徑。基因工程技術(shù)的應(yīng)用需要建立高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而高頻率的遺傳轉(zhuǎn)化體系又依賴于高頻率的再生體系，所以茶樹未成熟胚組織培養(yǎng)再生體系是為遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良打下基礎(chǔ)。茶樹幼胚組織培養(yǎng)的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設(shè)施設(shè)備、供電成本、耗材和人工成本。常規(guī)的茶樹幼胚組織培養(yǎng)方法，要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)基中才能正常生長，耗能大，人工操作成本高。如果能通過藥物抑菌的方法來改造培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基無需經(jīng)過高溫高壓滅菌，就能夠獲得茶樹的正常生長。然而，針對不同的植物品種難以篩選到一種合適的抗菌劑，往往是當(dāng)培養(yǎng)基抗菌時，植物組織的生長就受到抑制；而植物組織正常生長，就無法獲得滿意的抗菌效果。其原因，一是還沒有一種抗生素對所有的菌類都有效，而且抗生素藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效的濃度下，其殺菌、抗菌離子對植物組織直接產(chǎn)生傷害，有些則產(chǎn)生鹽害。必須選擇與植物組織親和、藥效期長(至少一個生長周期)，不產(chǎn)生鹽害并具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì)作為抗菌劑。因此，篩選合適的抗菌藥劑是抑菌組培技術(shù)得以應(yīng)用的關(guān)鍵。本專利技術(shù)就是為茶樹幼胚組織培養(yǎng)提供一種抑菌的培養(yǎng)方法。一方面可以降低茶樹幼胚組織培養(yǎng)對設(shè)施設(shè)備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設(shè)備，縮減了投資成本，電能消耗大幅度降低；另一方面，采用這種培養(yǎng)基開展茶樹幼胚組織培養(yǎng)，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外，由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染問題，又不會對茶樹生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響茶樹的正常生長，從根本上簡化了茶樹幼胚組織培養(yǎng)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法。本專利技術(shù)的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。本專利技術(shù)的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.1～2mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化培養(yǎng)基為：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LIBA+0.5～2mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌呤；所述GA3，指赤霉素；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：采取未成熟的果實，用洗衣粉浸泡沖洗15min后，去除果殼，用體積比為75％酒精消毒30s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒12min，無菌水反復(fù)沖洗不少于3次；消毒后的種子在無菌條件下剝開種殼，取出幼嫩的子葉型胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后長出各種類型的胚狀體或愈傷組織；培養(yǎng)室溫度為26℃，暗培養(yǎng)；5.分化培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的出各種類型的胚狀體或愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d后逐步分化出芽；多次繼代培養(yǎng)可以獲得更多的芽苗；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1400Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為25℃，光照12h，光照強度為1500Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。本專利技術(shù)的應(yīng)用效果：本專利技術(shù)的抑菌組培方法，利用化學(xué)試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達到滅菌或抑菌的作用，配制的培養(yǎng)基是無需高溫高壓滅菌。因此，在茶樹幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個階段，除了要考慮常用的評價指標(biāo)外，還要考慮污染率的問題。1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：通過實驗證實，本專利技術(shù)的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法與常規(guī)的茶樹幼胚組培方法相比，結(jié)果如表1所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的外植體培養(yǎng)的成活率差異不顯著。表1本專利技術(shù)的抑菌組培方法對茶樹幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響組培方式外植體數(shù)外植體污染數(shù)成活率(％)常規(guī)組培方法300100抑菌組培方法3001002.分化培養(yǎng)：本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)組培茶樹幼胚的分化率和污染率的比較，結(jié)果如表2所示，分化率和污染率二個指標(biāo)都差異不顯著。從瓶苗的生長狀況看，本專利技術(shù)的抑菌組培方法的培養(yǎng)基，由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素?fù)p失較少，其茶樹幼胚組培苗更壯，葉色更綠。表2本專利技術(shù)的抑菌組培方法對茶樹體胚分化率和污染率的影響3本專利技術(shù)的抑菌組培方法對茶樹幼胚生根率和污染率的影響：在組培苗生根過程中，本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)的茶樹幼胚組培方法相比，結(jié)果如表3所示，生根率和污染率的差異不顯著。表3本專利技術(shù)的抑菌組培方法的茶樹幼胚瓶苗生根情況組培方式平均生根率(％)平均污染率(％)常規(guī)組培方法870.8抑菌組培方法860.54.成本分析：本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表4。本專利技術(shù)抑菌組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。從直接費用計算，每年可以節(jié)約5.5萬元左右(以每天配制50L培養(yǎng)基計算)。常規(guī)組培需要添置高壓鍋等設(shè)備及日常維護，此外，常規(guī)組培還存在實驗室安本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?2)培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.1～2mg/L?2,4?D+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化培養(yǎng)基為：MS+1～3mg/L?6?BA+0.1～0.5mg/L?IBA+0.5～2mg/L?GA3+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/L?IBA+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6?BA，指6?芐氨基嘌呤；所述GA3，指赤霉素；所述IBA，指α?吲哚丁酸；所述2,4?D，指2,4?二氯苯氧乙酸；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；(3)無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)：采取未成熟的果實，用洗衣粉浸泡沖洗15min后，去除果殼，用體積比為75％酒精消毒30s，再用重量體積比為0.1％升汞浸泡消毒12min，無菌水反復(fù)沖洗不少于3次；消毒后的種子在無菌條件下剝開種殼，取出幼嫩的子葉型胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后長出各種類型的胚狀體或愈傷組織；培養(yǎng)室溫度為26℃，暗培養(yǎng)；(5)分化培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的出各種類型的胚狀體或愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d后逐步分化出芽；多次繼代培養(yǎng)可以獲得更多的芽苗；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強度為1400Lx；(6)生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm芽苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為25℃，光照12h，光照強度為1500Lx；(7)瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用抑菌培養(yǎng)基培育茶樹幼胚的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?2)培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+0.1～2mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化培養(yǎng)基為：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LIBA+0.5～2mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸鈉+1～5mg/L環(huán)絲氨酸+0.1～0.5mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述6-BA，指6-芐氨基嘌呤；所述GA3，指赤霉素；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；配制培養(yǎng)基時，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；(3)無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)：采取未...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葉乃興，林慶良，王鵬杰，陳丹，林浥，何冰媛，屈艷勤，鄭德勇，楊江帆，
申請(專利權(quán))人：福建農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建,35
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