本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽。本發(fā)明專利技術(shù)的割手密抑菌組培過程中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了割手密組培技術(shù)環(huán)節(jié)，降低了割手密組培成本；而且操作簡單，只需按不同的培養(yǎng)基配方配制后即可使用，實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好。本發(fā)明專利技術(shù)的割手密抑菌組培方法與常規(guī)的割手密組培方法相比，可以降低成本10％以上。
Tissue culture method for culturing cutting hand dense by using bacteriostatic culture medium
The present invention relates to antibacterial cultured plant tissue culture method of S.spontaneum, including culture container disinfection, preparation, sterile water preparation, incubation, differentiation and proliferation culture, rooting and transplanting medium bottle. The invention of S.spontaneum inhibition during tissue culture, culture medium and container without autoclaving, reducing the workload and energy consumption, simplifies the S.spontaneum tissue culture technology links, reduce the cost of tissue culture S.spontaneum; and the operation is simple, only according to the different culture medium can be used after preparation. Strong practicability, good generalization. Compared with the conventional hand cutting and tissue culture method, the cutting hand closed bacteriostatic tissue culture method can reduce the cost by more than 10%.
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法
本專利技術(shù)涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法，屬生物
技術(shù)介紹
割手密(SaccharumspontaneumL.)，又名甜根子草、小巴茅，為禾本科甘蔗屬多年生的草本植物，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、分蘗多等優(yōu)良特性，主要分布在熱帶、亞熱帶兩大氣候區(qū)，在我國南自海南島，北至秦嶺，東起臺(tái)灣東部，西至西藏的雅魯藏布江均有分布。割手密在甘蔗屬中種類豐富，且含有較高糖分，是甘蔗屬中最早用于甘蔗雜交育種的種質(zhì)資源，也是最有應(yīng)用價(jià)值的野生種質(zhì)資源，在甘蔗育種中具有重要的地位和作用。國內(nèi)外甘蔗育種專家利用割手密的優(yōu)質(zhì)基因?qū)υ耘嗾徇z傳基因進(jìn)行改良，先后培育出了多個(gè)優(yōu)良的甘蔗栽培品種，在生產(chǎn)上得到推廣應(yīng)用。雖然利用割手密與栽培甘蔗進(jìn)行有性雜交，進(jìn)而育成新的甘蔗品種，是甘蔗育種中的一種有效的途徑，然而在實(shí)際生產(chǎn)中卻面臨各種問題，尤其是花期不遇甚至不開花成了它們進(jìn)行有性雜交的嚴(yán)重障礙。科研工作者通過多年研究發(fā)現(xiàn)，利用體細(xì)胞雜交可以克服這個(gè)障礙，然而在進(jìn)行體細(xì)胞雜交過程中，外植體培養(yǎng)、獲得愈傷組織、再分化成苗等是不可缺少的組培環(huán)節(jié)。割手密組織培養(yǎng)的成本主要包括組培苗生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基、設(shè)施設(shè)備、供電成本、耗材和人工成本。常規(guī)的割手密組織培養(yǎng)方法要求外植體接種在高溫高壓滅菌后的無菌培養(yǎng)基中才能正常生長，耗能大，人工操作成本高。如果能通過抑菌的方法來改造培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基在不需要進(jìn)行高溫高壓滅菌，就能夠使割手密正常生長。這樣，一方面可以降低割手密組織培養(yǎng)對設(shè)施設(shè)備的要求，尤其不需要高溫高壓滅菌所需配置的高壓鍋設(shè)備，縮減了投資成本，電能消耗也將大幅度降低；另一方面，采用這種培養(yǎng)基開展割手密組織培養(yǎng)，組培環(huán)節(jié)大為簡化，人工操作的速度大幅提高，從而降低了人工成本。此外，由于改造后的培養(yǎng)基自身具有殺菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制組織培養(yǎng)過程中的污染問題，又不會(huì)對割手密生長產(chǎn)生毒害或抑制，即不影響割手密的正常生長，從根本上簡化了割手密組織培養(yǎng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法。本專利技術(shù)的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。本專利技術(shù)的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：1.培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?.培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1～5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化及增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5～2mg/LIAA+0.5～2mg/LKT+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+2～5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；配制培養(yǎng)基時(shí)，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；3.無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；4.誘導(dǎo)培養(yǎng)：取田間生長健壯且無病蟲害的割手密無性系頂端部分，用體積比為75％的乙醇表面消毒，剝離外層葉鞘，取白色心葉的肥厚帶中生長點(diǎn)以上6cm內(nèi)的幼嫩心葉，將其切成不超過3mm厚度的圓片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后誘導(dǎo)出愈傷組織；培養(yǎng)室溫度為26℃，暗培養(yǎng)；5.分化及增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的割手密愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d后逐步誘導(dǎo)出幼芽；將幼芽接種到增殖培養(yǎng)基上，逐步發(fā)育成叢生苗，每15d轉(zhuǎn)接一次，大量增殖；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1600Lx；6.生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1800Lx；7.瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的基質(zhì)中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃，所述透水性好的基質(zhì)，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。本專利技術(shù)的應(yīng)用效果：本專利技術(shù)的抑菌組培方法，利用化學(xué)試劑添加到各種培養(yǎng)基中，達(dá)到滅菌或抑菌的作用，配制的培養(yǎng)基是無需高溫高壓滅菌。因此，在割手密誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各個(gè)階段，除了要考慮常用的評價(jià)指標(biāo)外，還要考慮污染率的問題。1.誘導(dǎo)培養(yǎng)：通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本專利技術(shù)的一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法與常規(guī)的割手密組培方法相比，結(jié)果如表1所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，外植體誘導(dǎo)率無明顯差異。表1本專利技術(shù)的抑菌組培方法對割手密誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響組培方式外植體數(shù)外植體污染數(shù)誘導(dǎo)率(％)常規(guī)組培方法752665.3抑菌組培方法792765.82.增殖培養(yǎng)：本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)組培割手密的增殖倍數(shù)和污染率的比較，結(jié)果如表2所示，增殖倍數(shù)和污染率二個(gè)指標(biāo)都差異不顯著。表2本專利技術(shù)的抑菌組培方法對割手密增殖倍數(shù)和污染率的影響組培方式增殖倍數(shù)平均污染率(％)常規(guī)組培方法2.20.5抑菌組培方法2.30.43.在組培苗生根過程中，本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)的割手密組培方法相比，由于不經(jīng)過高溫高壓滅菌，激素和營養(yǎng)元素?fù)p失較少，割手密組培苗生根效果更好，結(jié)果如表3所示，生根率和污染率的差異不顯著。表3本專利技術(shù)的抑菌組培方法的割手密瓶苗生根情況組培方式生根率(％)平均污染率(％)常規(guī)組培方法810.6抑菌組培方法830.54.成本分析：本專利技術(shù)的抑菌組培方法與常規(guī)組培的成本分析見表4。本專利技術(shù)組培省去了高壓滅菌環(huán)節(jié)，簡化了組培程序，提高了工作效率。從直接費(fèi)用計(jì)算，每年可以節(jié)約5.5萬元左右(以每天配制50L培養(yǎng)基計(jì)算)。常規(guī)組培還需要添置高壓鍋等設(shè)備及其維修，并且存在實(shí)驗(yàn)室安全等。表4本專利技術(shù)的割手密簡便組培方法與常規(guī)組培的成本分析表本專利技術(shù)具有如下有益效果：1.本專利技術(shù)的割手密抑菌組培方法中，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡化了割手密組培技術(shù)環(huán)節(jié)，降低了割手密組培成本。2.本專利技術(shù)的割手密抑菌組培方法，操作簡單，只需本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?2)培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1～5mg/L?2,4?D+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化及增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5～2mg/L?IAA+0.5～2mg/L?KT+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+2～5mg/L?NAA+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述2,4?D，指2,4?二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6?糠氨基嘌呤；所述NAA，指α?萘乙酸；配制培養(yǎng)基時(shí)，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；(3)無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)：取田間生長健壯且無病蟲害的割手密無性系頂端部分，用體積比為75％的乙醇表面消毒，剝離外層葉鞘，取白色心葉的肥厚帶中生長點(diǎn)以上6cm內(nèi)的幼嫩心葉，將其切成不超過3mm厚度的圓片，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d后誘導(dǎo)出愈傷組織；培養(yǎng)室溫度為26℃，暗培養(yǎng)；(5)分化及增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的割手密愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，30d后逐步誘導(dǎo)出幼芽；將幼芽接種到增殖培養(yǎng)基上，逐步發(fā)育成叢生苗，每15d轉(zhuǎn)接一次，大量增殖；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1600Lx；(6)生根培養(yǎng)：取高度為3～5cm苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d后成為完整植株；培養(yǎng)室溫度為26℃，光照12h，光照強(qiáng)度為1800Lx；(7)瓶苗移栽：將生根培養(yǎng)獲得的完整植株取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的多菌靈浸泡30min后，移栽至透水性好的基質(zhì)中，大棚上層用遮光網(wǎng)遮蓋，移栽的環(huán)境溫度為22～28℃，所述透水性好的基質(zhì)，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用抑菌培養(yǎng)基培育割手密的組培方法，包括培養(yǎng)容器消毒、培養(yǎng)基配制、無菌水制備、誘導(dǎo)培養(yǎng)、分化及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和瓶苗移栽，其特征在于：(1)培養(yǎng)容器消毒：將培養(yǎng)瓶、瓶蓋及接種用的塑料盤在100mg/L次氯酸鈉+10mg/L環(huán)絲氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸鈉的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?2)培養(yǎng)基配制：誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1～5mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；分化及增殖培養(yǎng)基為：MS+0.5～2mg/LIAA+0.5～2mg/LKT+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；生根培養(yǎng)基為1/2MS+2～5mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸鈉+0.5～2.0mg/L環(huán)絲氨酸+10～50mg/L特美汀+10～50mg/L丙酸鈣+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸鈉+30g/L蔗糖+3.0g/L瓊脂粉，pH5.8；所述MS，為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述IAA，指吲哚乙酸；所述KT，指6-糠氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；配制培養(yǎng)基時(shí)，先稱各培養(yǎng)基配方中的蔗糖和瓊脂粉，加培養(yǎng)基總重量1/2的自來水，加熱至瓊脂粉完全溶解，再按各培養(yǎng)基配方配齊其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到消毒過的培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固，備用；(3)無菌水的制備：采用次氯酸鈉、環(huán)絲氨酸、十二烷基磺酸鈉和水配制無菌水，終濃度為100mg/L次氯酸鈉、10mg/L環(huán)絲氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸鈉，現(xiàn)配現(xiàn)用；(4)誘導(dǎo)培...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊穎穎，高世武，林慶良，許莉萍，闕友雄，蘇亞春，郭晉隆，吳期濱，
申請(專利權(quán))人：福建農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：福建,35
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