重組人VEGF多肽腫瘤疫苗制造技術

本發明專利技術公開了一種重組人VEGF多肽腫瘤疫苗，利用人工合成的方法獲得人VEGF抗原表位核酸序列，將其插入噬菌體Qβ外殼蛋白基因的C末端，利用共表達系統在大腸桿菌BL21（DE3）中同時表達噬菌體Qβ外殼蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外殼蛋白，經純化后獲得在外表呈遞有人VEGF抗原表位的Qβ病毒樣顆粒。本發明專利技術的重組人VEGF?Qβ蛋白通過免疫小鼠產生抗人VEGF抗體，該抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF

【技術實現步驟摘要】
重組人VEGF多肽腫瘤疫苗
本專利技術涉及醫學生物技術及免疫學領域，具體地，涉及人VEGF多肽疫苗的構建方法。技術背景研究表明，血管生成在腫瘤的發生發展中具有重要作用，抑制腫瘤血管生成已成為一種新的治療方法。許多活性因子已被確認參與這個復雜的過程，其中包括：aFGF、bFGF、TGF-α、VEGF等。然而，過去數年所做的研究已確立在腫瘤血管生成中，血管內皮生長因子(VEGF)是目前已知的一個最有效的和最特異的促血管生成因子。在大多數腫瘤中，VEGFmRNA是過度表達的，因而被認為是抑制腫瘤血管生成最有效的靶標。多種策略已被用來抑制VEGF的作用，其中包括靶向VEGF受體(VEGFR)、使用基因療法提供反義寡核苷酸、使用可溶性VEGFR、受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑的開發,以及針對VEGF的單克隆抗體。目前最有前景的方法是重組的人源化的小鼠抗人VEGF單克隆抗體。此抗體已經在轉移性癌癥患者進行過測試。然而,運用抗體進行治療有很多缺點，重要的是，被動免疫策略牽涉把抗體注入病人體內,它的免疫力是短暫的，因為抗體在機體循環中會很快被清除。其次，單克隆抗體本身也是免疫原，導致其不能長期使用。再者，為了維持有效的免疫必須持續大量給患者輸入抗體，患者須承受嚴重的經濟負擔。使用疫苗來預防或治療腫瘤是一種極具吸引力的方式，因為疫苗療法的預期副作用最小。抗腫瘤疫苗包括完整的細胞疫苗、蛋白質和DNA疫苗,以及肽疫苗；每種類型的抗腫瘤疫苗都有其優點和局限性。用肽制備的抗腫瘤疫苗目前引起研究者很大的興趣，因為這種形式的疫苗較為安全（沒有病原體和致癌物質的潛在威脅）、穩定及容易制備，能夠大大降低經濟成本。重要的是，相對于被動免疫而言，肽疫苗能夠致使機體產生持續的免疫反應和記憶。但是肽疫苗的缺陷在于未經修飾的肽極少具有免疫原性。我們通過將VEGF抗原肽呈遞在高度有序、高度重復的Qβ病毒樣顆粒上賦予了其極高的免疫原性，有望作為一種有效的方法來預防或治療腫瘤的發生發展。
技術實現思路
本專利技術的目的在于，將人VEGF抗原肽呈遞在高度有序、高度重復的Qβ病毒樣顆粒上賦予其極高的免疫原性，為腫瘤免疫治療提供一種新的治療藥物。為了實現上述目的，本專利技術的技術方案是：一種重組人VEGF多肽腫瘤疫苗，其特征在于，利用共表達系統在大腸桿菌BL21（DE3）中同時表達噬菌體Qβ外殼蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外殼蛋白，經純化后獲得在外表呈遞有人VEGF抗原表位的Qβ病毒樣顆粒。該融合蛋白疫苗的特點是，用該疫苗免疫小鼠后，小鼠體內可產生高滴度的抗人VEGF抗體，并且該抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF165的生物學活性。并且利用這種呈遞方式獲得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可對C57BLACK6小鼠體內的TC-1腫瘤細胞起到一定的抑制作用。附圖說明圖1顯示了通過共表達純化后得到的病毒樣顆粒；圖2顯示重組人VEGF多肽疫苗加鋁佐劑免疫小鼠后產生了較好的抗體應答；圖3顯示重組人VEGF多肽疫苗加鋁佐劑免疫小鼠后產生的特異性抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF165的生物學活性。圖4顯示利用共表達將抗原肽呈遞在Qβ病毒樣顆粒表面的方式獲得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可對C57BLACK6小鼠體內的TC-1腫瘤細胞起到一定的抑制作用。具體實施方式依照本專利技術的技術方案，采用人工合成的方法獲得人VEGF抗原肽的核酸序列，將其插入噬菌體Qβ外殼蛋白基因的C末端，利用共表達的方式在大腸桿菌BL21（DE3）中同時高效表達噬菌體Qβ外殼蛋白以及C末端插有人VEGF抗原肽的Qβ外殼蛋白，表達產物經超聲破碎、硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心的純化得到外表呈遞有人VEGF抗原肽的Qβ病毒樣顆粒疫苗。該疫苗與鋁佐劑混合后免疫小鼠獲得的特異性抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF165的生物學活性。同時，通過此方法利用與人VEGF抗原肽同源的小鼠VEGF抗原肽構建的疫苗免疫小鼠后能抑制C57BLACK6小鼠體內TC-1腫瘤細胞的生長。實施例實施例1：重組人VEGF多肽疫苗原核表達質粒的構建采用人工合成的方法獲得C末端帶有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的噬菌體Qβ外殼蛋白基因表達序列，并克隆入載體pRSFDuet1第一個表達單元中，同時將合成的上游引入BamHⅠ，下游引入EcoRⅠ酶切位點的人VEGF抗原肽核酸序列連接在Qβ外殼蛋白基因表達序列的C末端；在載體pRSFDuet1第二個表達單元中插入噬菌體Qβ外殼蛋白基因表達序列。實施例2：重組人VEGF多肽疫苗原核表達將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，挑取單克隆至含有卡那霉素（50mg/mL）的LB培養基中，過夜培養12-16小時后按1:20的比例轉接至含卡那霉素的新鮮LB培養基中繼續培養2-3小時，待菌液OD值達到0.5時，加入IPTG（1mmol/L）誘導表達3小時，誘導溫度37℃。實施例3：重組人VEGF多肽疫苗的純化誘導表達后的菌液以4500rpm離心20min收集菌體，將菌體用PBS重懸后進行超聲破碎，條件為15%的功率，工作5sec，停5sec，總時間10min。超聲破碎后的樣品以12000rpm離心10min，取上清加入硫酸銨至飽和度為40%，4℃混勻30min，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用PBS溶解，溶解產物用10-50%的蔗糖溶液進行密度梯度離心（40000rpm，3h），將含有病毒樣顆粒的條帶取出，經G-25脫鹽純化柱將蔗糖置換成PBS得到純化好的重組人VEGF多肽疫苗（圖1）。實施例4：重組人VEGF多肽疫苗的動物免疫將純化后的疫苗50ug與40mg/mL的鋁佐劑按3:1的體積比混合后分別在0天、14天、28天進行三次皮下免疫小鼠，第三次免疫后一周采血用ELISA進行人VEGF特異性抗體的檢測（圖2）。以此證明經重組人VEGF多肽疫苗免疫后，小鼠產生了高水平的特異性抗人VEGF抗體應答。實施例5：免疫小鼠血清中IgG抗體的純化用4倍體積的醋酸鈉緩沖液(60mM，pH值4.0)稀釋血清，用0.5M的氫氧化鈉調pH值至4.5。將辛酸(25μl/ml)逐滴加入樣品中，邊滴加邊攪拌，滴加完后繼續攪拌30min，8000r/min離心30min，取上清，按上清液10份加1份10xPBS混合,用0.5M的氫氧化鈉調pH值至7.4。加入硫酸銨(0.277g/ml)攪拌30min后，8000rpm/min離心15min，棄上清液，將沉淀懸浮于PBS(起始腹水體積的1/5-1/10)中。懸浮液用100倍體積的PBS透析過夜。實施例6：內皮細胞生長分析將HUVEC細胞以3×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，在含有1%牛血清的DMEM培養基中過夜培養，然后加入不同濃度（0.39-100ng/ml）從小鼠血清中純化的IgG抗體以及VEGF165至終濃度25ng/ml，培養三天后加入10%的CCK-8，反應4-8小時后在450nm波長處讀取吸光度值（圖3）。實施例7：體內腫瘤研究分別將純化的Qβ載體、人多肽VEGF疫苗以50ug/只的劑量皮下免疫C57BLACK6小鼠，以等體積PBS進行相同免疫作為空白組對照。每組8只小鼠，添加鋁佐劑，每本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組人VEGF多肽腫瘤疫苗經主動免疫動物后，可以突破動物自身的免疫耐受，誘發出抗自身VEGF蛋白的抗體，從而拮抗VEGF的病理性功能，抑制動物腫瘤生長。

【技術特征摘要】
1.一種重組人VEGF多肽腫瘤疫苗經主動免疫動物后，可以突破動物自身的免疫耐受，誘發出抗自身VEGF蛋白的抗體，從而拮抗VEGF的病理性功能，抑制動物腫瘤生長。2.權利要求1中所述重組人VEGF多肽腫瘤疫苗，其構建...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬雁冰，白紅妹，黃惟巍，夏燁，劉存寶，孫文佳，楊旭，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫學生物學研究所，
類型：發明
國別省市：云南,53