同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體及其雜交瘤細胞株和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體及其雜交瘤細胞株和應用，該雜交瘤細胞株穩定性好，經過體外傳代以及細胞凍存復蘇仍能穩定分泌單克隆抗體，所分泌的單克隆抗體可以同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒，與1型鴨甲型肝炎病毒的親和常數在10

【技術實現步驟摘要】
同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體及其雜交瘤細胞株和應用
本專利技術涉及一種單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株、以及該單克隆抗體的用途。
技術介紹
鴨甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雛鴨發生急性、高度致死性傳染病，主要感染4周齡以下的雛鴨，其中1周齡以內的雛鴨死亡率高達95％，主要特征病變為患病鴨的肝臟腫大和出血。根據基因組特征和抗原中和試驗，將鴨甲型肝炎病毒分為3個基因型或血清型，即鴨甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3)。其中鴨甲型肝炎病毒1型與2型不產生交叉保護作用，與3型有部分交叉中和反應。目前我國養鴨生產中均有1型和3型鴨甲型肝炎的發生和流行，但尋找1型和3型鴨甲型肝炎病毒的共同抗體并建立能同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的簡便快速檢測方法一直是學術界和生產中沒有很好解決的難題。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于研制既能識別1型鴨甲型肝炎病毒、也能識別3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供廣譜、特異性強、親和力高的檢測抗體。為實現上述專利技術目的，經研究，本專利技術提供如下技術方案：1.雜交瘤細胞株DHAV-MAb1，保藏編號為CCTCCNO：C201701。2.由雜交瘤細胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體。3.所述單克隆抗體在制備單獨檢測1型或3型鴨甲型肝炎病毒以及同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的試劑中的應用。本專利技術的有益效果在于：本專利技術以純化的1型鴨甲型肝炎病毒作為免疫原及篩選抗原，通過單克隆抗體技術篩選出了能夠穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經實驗證實，該雜交瘤細胞株穩定性好，經過體外傳代以及細胞凍存復蘇仍能穩定分泌單克隆抗體；所分泌的單克隆抗體可以同時識別1型和3型鴨甲型肝炎病毒，與1型鴨甲型肝炎病毒的親和常數在109數量級以上，且不與鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌發生特異性反應，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供了廣譜、特異性強、親和力高的檢測抗體，可用于制備單獨檢測1型或3型鴨甲型肝炎病毒以及同時檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的試劑。生物材料保藏雜交瘤細胞株DHAV-MAb1于2017年1月18日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學)，保藏編號為CCTCCNO：C201701。附圖說明圖1為免疫小鼠脾細胞、SP2/0小鼠骨髓瘤細胞及飼養細胞的形態，其中a為免疫小鼠脾細胞，b為培養24h的飼養細胞，c為培養7d的飼養細胞，d為SP2/0小鼠骨髓瘤細胞。圖2為融合后的雜交瘤細胞，其中1為培養5d后的雜交瘤細胞；2為培養9d后的雜交瘤細胞。圖3為純化腹水的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白Marker，1為雜交瘤細胞株DHAV-MAb1的純化腹水。圖4為單克隆抗體的親和力常數測定。圖5為膠體金顆粒與金標單克隆抗體的紫外光譜。圖6為膠體金試紙條的組裝示意圖。圖7為膠體金試紙條的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗包被濃度優化，1-6分別為多抗濃度0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL和1.6mg/mL。圖8為膠體金試紙條的羊抗鼠IgG包被濃度優化，1-6分別為羊抗鼠IgG濃度0.2mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、1.4mg/mL、1.8mg/mL和2.0mg/mL，7為陰性。圖9為膠體金試紙條的金標單克隆抗體包被濃度優化，1-8分別為1mL金標單克隆抗體溶液離心后的沉淀用100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL和450μL金標抗體重懸液稀釋。圖10為膠體金試紙條檢測1型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗結果，1-9分別為陽性鴨胚尿囊液(0.6mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256稀釋，10為陰性對照。圖11為膠體金試紙條檢測3型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗結果，1-7分別為陽性鴨胚尿囊液(0.3mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64稀釋，8為陰性對照。圖12為膠體金試紙條檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的特異性試驗結果，1-5和7分別為3型鴨甲型肝炎病毒CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株，6和8-10分別為1型鴨甲型肝炎病毒BZB株、CD1231株、DY0903株和X株，11為陰性對照。圖13為膠體金試紙條檢測鴨常見的其它致病病原的特異性試驗結果。圖14為膠體金試紙條檢測1型和3型鴨甲型肝炎病毒的重復性試驗結果，1-3分別為第1、2、3批次的膠體金試紙條，a為檢測1型鴨甲型肝炎病毒；b為檢測3型鴨甲型肝炎病。圖15為膠體金試紙條的穩定性試驗結果，1-3分別為保存1、2、3個月。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案和有益效果更加清楚，下面將結合附圖對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中使用的主要材料如下：1、細胞、菌株與毒株SP2/0小鼠骨髓瘤細胞購自中國科學院細胞庫；1型鴨甲型肝炎病毒(BZB株、CD1231株、DY0903株和X株)、3型鴨甲型肝炎病毒(CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株)、鴨病毒性腸炎病毒(DPVCHv株)、鴨乙肝病毒(DHBV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨大腸桿菌(E.coli,保藏號：CVCC83003)、鴨沙門氏菌(SE,保藏號：CMCC50083)、鴨疫里默氏桿菌(RACH-1株)均由四川農業大學禽病防治研究中心保存提供。2、試驗動物6-8周齡和10-12周齡SPFBALB/c雌性小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司；10日齡鴨胚購自四川農業大學農場。3、試劑與材料HAT培養基添加劑(50×)、聚乙二醇(PEG1450)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產品；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養基為Gibco公司產品；牛血清白蛋白(BSA)為BIOSHARP公司產品；鼠單克隆抗體Ig類亞類鑒定酶標二抗套裝購自北京博奧龍免疫技術有限公司；一次性細胞瓶、細胞培養板和ELISA酶標板購自美國Corning公司。兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗由四川農業大學禽病防治研究中心保存提供；20nm膠體金溶液、玻璃纖維素膜(MA0280、GL0194)、硝酸纖維素(NC)膜(SartoriusCN140，SartoriusCN95，vivid170和Millipore135)、樣品墊(GL-b03和GL-b04)、吸收墊(H5072)、底板(DB-6)、白色塑料卡(A-9)和銜接膠帶均購自上海杰一生物技術有限公司；玻璃纖維素膜(CB-0801、SB06、VL78)購自上海金標生物科技有限公司。4、儀器設備超純水儀(WaterPro，美國Labconco公司)；核酸蛋白檢測儀(SmartSpec3000，美國Bio-rad公司)；凝膠成相系統(GelDoc3000，美國Bio-rad公司)；倒置本文檔來自技高網...

【技術保護點】
雜交瘤細胞株DHAV?MAb1，保藏編號為CCTCC?NO：C201701。

【技術特征摘要】
1.雜交瘤細胞株DHAV-MAb1，保藏編號為CCTCCNO：C201701。2.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株DHAV-MAb1分泌...

【專利技術屬性】
技術研發人員：汪銘書，程安春，楊旸，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：四川,51