日本血吸蟲地域特異性相關單核苷酸多態性及其應用制造技術

本發明專利技術公開了日本血吸蟲地域特異性相關基因ND2及其應用。具體地，本發明專利技術提供了一種檢測日本血吸蟲地域特異性的方法，它包括檢測個體的日本血吸蟲ND2基因的兩個單核苷酸多態性SNP位點，從而區分日本血吸蟲來源于湖區還是山區。基于本發明專利技術，通過簡單的PCR擴增和測序，就能分辨來自中國西南山區和長江中下游湖沼區的日本血吸蟲，有助于準確、快速地鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，判斷是否異地感染的輸入性病例，并為研究日本血吸蟲的遺傳和進化提供了依據。

【技術實現步驟摘要】
日本血吸蟲地域特異性相關單核苷酸多態性及其應用
本專利技術屬于分子生物和遺傳學領域，具體地說，本專利技術涉及一種利用線粒體上的單核苷酸多態性位點作為分子標記鑒定日本血吸蟲地域株的方法以及線粒體DNA在日本血吸蟲群體的遺傳變異和進化方面中的應用。
技術介紹
日本血吸蟲是一種人獸共患寄生蟲，主要流行于東亞及東南亞地區。目前，我國尚有12個血吸蟲病流行省(直轄市、自治區)，約2億人受此病威脅，18萬人受到感染。流行地區主要分為西南山區和長江中下游湖沼區2種生態類型，不同的生態環境內可能存在不同的蟲株，而不同的蟲株對宿主的感染力和致病性可能存在差異。近年來，眾多的分子標記被應用于日本血吸蟲的群體地域遺傳研究中，如等位酶、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性(RAPD)、微衛星(STR)等。然而，日本血吸蟲的線粒體基因組序列全長為14085nt，包括12個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rDNA基因(參考序列GenBankID:10445372)。因此，從這些基因中找到地域高相關性基因，從而鑒別日本血吸蟲的不同地域株、鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，對于我國血吸蟲病的預防和控制有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的就是提供一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法及檢測試劑盒。本專利技術第一方面，提供了一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法，包括步驟：i)日本血吸蟲ND2基因特異性引物擴增樣品的日本血吸蟲ND2基因，得到擴增產物；和2)檢測擴增產物是否存在以下單核苷酸多態性SNP位點：第30位T→A；和/或第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優選例中，當第30位為T和/或第811位為G時，所述的日本血吸蟲為湖區日本血吸蟲；或當第30位為A和/或第811位為A時，所述的日本血吸蟲為山區日本血吸蟲。在另一優選例中，所述的日本血吸蟲樣本包括蟲卵、毛蚴、尾蚴、和/或成蟲樣本。在另一優選例中，所述的湖區日本血吸蟲包括中國長江中下游湖區日本血吸蟲。在另一優選例中，所述的山區日本血吸蟲包括中國西南山區日本血吸蟲。本專利技術第二方面，提供了一種日本血吸蟲ND2基因或其單核苷酸多態性位點在制備鑒別日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑或試劑盒中的用途，其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優選例中，所述的試劑包括引物、探針、芯片、或抗體。在另一優選例中，所述的試劑盒含有一種或多種選自下組的試劑：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種所述SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種所述SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種所述SNP位點的芯片；(d)用于檢測一種或多種所述SNP位點所對應的氨基酸突變的特異性抗體。在另一優選例中，所述的特異性引物具有SEQIDNO:2-3所示的序列。本專利技術第三方面，提供了一種檢測日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑盒，它包括：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種SNP位點的芯片；(d)用于檢測一種或多種SNP位點所對應的氨基酸突變的特異性抗體；其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。在另一優選例中，所述試劑盒含有特異性擴增日本血吸蟲ND2基因單核苷酸多態性的特異性引物，并且所述的引物擴增出的擴增產物的長度為100-2000bp。在另一優選例中，所述的特異性引物具有SEQIDNO:2-3所示的序列。在另一優選例中，所述的試劑盒還任選地含有選自下組的試劑：(a)與所述SNP位點的結合的探針；(b)識別所述SNP位點的限制性內切酶。本專利技術第四方面，提供了一種試劑在制備檢測檢測日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑盒的用途，其中所述試劑選自下組：(a)日本血吸蟲ND2基因的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種所述SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種所述SNP位點的芯片；或(d)用于檢測一種或多種所述SNP位點所對應的氨基酸突變的特異性抗體。本專利技術第五方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸如SEQIDNO.:4-48所示。應理解，在本專利技術范圍內中，本專利技術的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1為中國大陸9個流行區(安徽貴池、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸蟲樣本線粒體序列在本專利技術提供的第一個單核苷酸多態性位(ND2基因第30個堿基)的序列比對結果。其中：GC代表安徽貴池，TL代表安徽銅陵，LG代表湖南岳陽，WY代表湖南常德，WH代表湖北武漢，NC代表江西南昌，DC代表江西都昌，SC代表四川西昌，YN代表云南洱源。圖2為中國大陸9個流行區(安徽貴池、安徽銅陵、湖南岳陽、湖南常德、湖北武漢、江西南昌、江西都昌、四川西昌和云南洱源)的日本血吸蟲樣本線粒體序列在本專利技術提供的第二個單核苷酸多態性位點(ND2基因第811個堿基)的序列比對結果。各縮寫代表地域同圖1.具體實施方式本專利技術人經過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發現和證明了日本血吸蟲ND2基因組序列與日本血吸蟲地域特異性密切相關，因此可作為輔助性檢測日本血吸蟲地域特異性(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎上完成了本專利技術。具體地，本專利技術人通過對119個來自不同流行區的日本血吸蟲成蟲線粒體基因組全序列進行二代測序和序列比對篩選所獲得了2個來源于ND2基因的單核苷酸多態性位點，這2個單核苷酸多態性位點可作為鑒別日本血吸蟲在中國區域山區和湖區株的有效遺傳標記。基于本專利技術成果，通過簡單的PCR擴增和測序，就能分辨來自中國西南山區和長江中下游湖沼區的日本血吸蟲，有助于準確、快速地鑒定血吸蟲病患者的初始感染地，判斷是否異地感染的輸入性病例，并為研究日本血吸蟲的遺傳和進化提供了依據。日本血吸蟲線粒體基因ND2自上世紀80年代以來，線粒體DNA(mtDNA)分析方法在遺傳學、系統分類學、分子生態學、群體遺傳及人類學等方面得到了廣泛的應用。線粒體DNA具有分子結構簡單、無內含子，突變率高、進化速度快，穩定母系遺傳、無重組等特點，非常有利于進行遺傳進化及親緣學分析，已經成為相關領域中應用最廣泛的分子標記。近年來，眾多的分子標記被應用于日本血吸蟲的群體遺傳研究中，如等位酶、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性(RAPD)、微衛星(STR)等。然而線粒體基因作為一種中性的分子標記，因其突變率高、進化速度快(是核基因的四倍)、遺傳穩定的特點，在日本血吸蟲遺傳分類鑒定方面，具有更大的優勢。日本血吸蟲的線粒體基因組序列全長為14085nt，包括12個蛋白編碼基因、22個tRNA基因和2個rDNA基因(參考序列GenBankID:10445372)。其中NADH脫氫酶第二亞基(NADHdehydrogenasesubun本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法，包括步驟：i)日本血吸蟲ND2基因特異性引物擴增樣品的日本血吸蟲ND2基因，得到擴增產物；和2)檢測擴增產物是否存在以下單核苷酸多態性SNP位點：第30位T→A；和/或第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQ?ID?NO:1。

【技術特征摘要】
1.一種鑒別日本血吸蟲地域特異性的方法，包括步驟：i)日本血吸蟲ND2基因特異性引物擴增樣品的日本血吸蟲ND2基因，得到擴增產物；和2)檢測擴增產物是否存在以下單核苷酸多態性SNP位點：第30位T→A；和/或第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。2.如權利要求1所述的方法，當第30位為T和/或第811位為G時，所述的日本血吸蟲為湖區日本血吸蟲；或當第30位為A和/或第811位為A時，所述的日本血吸蟲為山區日本血吸蟲。3.如權利要求1所述的方法，所述的日本血吸蟲樣本包括蟲卵、毛蚴、尾蚴、和/或成蟲樣本。4.一種日本血吸蟲ND2基因或其單核苷酸多態性位點在制備鑒別日本血吸蟲地域特異性和/或判斷血吸蟲病初始感染地的試劑或試劑盒中的用途，其中所述的單核苷酸多肽性(SNP)位點是：第30位T→A；第881位G→A；其中，核苷酸位置編號基于SEQIDNO:1。5.如權利要求4所述的用途，所述的試劑包括引物、探針、芯片、或抗體。6.如權利要求4所述的用途，所述的試劑盒含有一種或多種選自下組的試劑：(a)日本血吸蟲ND2基因或一種或多種所述SNP位點的特異性引物；(b)用于檢測一種或多種所述SNP位點的特異性探針；(c)用于檢測一種或多種所述S...

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡薇，殷明波，李鴻雁，馮正，徐斌，莫筱瑾，張颋，周曉農，
申請(專利權)人：復旦大學，中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，
類型：發明
國別省市：上海,31