基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及引物制造技術

基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及引物。本發明專利技術公開了一種檢測結核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及其應用。本發明專利技術公開一組檢測檢測樣品中結核分枝桿菌的基因是否發生耐藥性突變的引物，引物序列為SEQ?NO.1至SEQ?NO.10所示序列。包含了上述引物的試劑盒可對待測樣本中提取的DNA中四種耐藥性指示基因(embB、rpsL、inhA和katG)的突變情況進行檢測。本發明專利技術通過高分辨熔解曲線(HRM)技術，在較短的時間內檢測待測樣品中結核分枝桿菌的四個耐藥基因的突變情況，結果靈敏度高、特異性較好，分析過程簡便。

【技術實現步驟摘要】
基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及引物
本專利技術屬于生物技術，具體涉及一種基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒及其引物、應用。
技術介紹
結核病是當今全球范圍對人類最具有威脅性的感染性疾病之一，而耐多藥結核病(multi-drugresistanttuberculosis,MDR-TB)以及廣泛耐藥結核病(extensivedrugresistanttuberculosis,XDR-TB)的出現使得結核病的流行態勢更為嚴峻。WHO2008報道顯示，全球結核病總耐藥率為20.0％，耐多藥率為5.3％，每年新出現耐多藥結核病患者約50萬人，廣泛耐藥結核病患者5萬人。隨著世界范圍內人口流動的增加，耐藥性結核病例過去20年來一直呈上升態勢，嚴重地威脅著結核病控制工作的進展。鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇屬于世界衛生組織推薦的抗結核一線藥物，對結核病的治療具有非常重要的作用，及時進行結核分枝桿菌對鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇的耐藥性檢測可指導臨床用藥，避免延誤治療。結核分枝桿菌對抗結核化療藥物異煙肼(INH)的耐藥機制較為復雜，約92％的INH耐藥菌與katG，inhA和ahpC三個基因突變有關,其中katG和inhA基因是主要的耐藥基因,katG的丟失或突變導致其編碼的過氧化氫-過氧化物酶活性喪失或下降，而inhA基因突變減弱了異煙肼對分枝桿菌酸生物合成的抑制作用；結核分枝桿菌耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉移酶的編碼基因，embABC操縱子突變或emb蛋白表達增高有關，該操縱子由embC、embA和embB三個基因組成，其中embB基因(尤其是306位密碼子)突變是耐乙胺丁醇產生的主要分子機制；鏈霉素耐藥是由于其核糖體S12蛋白編碼基因rpsL或16SrRNA編碼基因rr8突變所致，80％耐鏈霉素結核分枝桿菌臨床分離株可見rpsL突變。結核分枝桿菌的臨床檢測一直以來主要依靠藥物藥敏試驗，但傳統的在固體培養基上進行的藥物敏感試驗周期長、敏感性低，嚴重影響了患者的早期診斷和治療。基因芯片樣本的制備和標記較繁瑣，儀器昂貴，檢測成本高。PCR-限制性片斷長度多態性分析只能分析已知序列特異位點的基因突變。快速培養儀檢測系統儀器和試劑依賴進口費用高昂。高分辨溶解曲線(HighResolutionMelting，HRM)技術是一種新興的檢測技術，HRM技術是在常規聚合酶鏈式反應(PCR)過程中飽和熒光染枓如EvaGreen與DNA雙鏈結合，當通過加熱升溫使DNA雙鏈解離時，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點雙鏈堿基間不匹配會使雙鏈DNA在此位點首先解開，通過實時監測升溫過程中的熒光強度，從熒光強度與時間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP。不同位點、雜合子與否、GC含量、擴增子長度等都會影響熔解曲線的峰形，所以HRM分析能夠有效區分不同突變位點、SNP位點和擁有不同GC含量的擴增片段。其操作方法簡便，樣品經PCR擴增后直接進行HRM，PCR產物無需轉入其它分析裝置，可直接在同一個PCR管內進行分析，實現閉管式操作，不會產生氣溶膠污染。是一種可以快速、準確、操作簡便、靈敏度高和避免交叉污染的檢測技術。
技術實現思路
為此，本專利技術要解決的技術問題在于克服現有技術中結核分枝桿菌耐藥性檢測周期長、敏感度低的問題，從而提供一種基于HRM技術快速準確檢測結核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，以準確可靠、快速、簡便地檢測結核桿菌耐藥性及多重耐藥性。本專利技術提供了一種基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組，所述引物組包含至少一種選自以下的引物組：引物組1：包含堿基序列如SEQNO.1所示的引物katG315-F和堿基序列如SEQNO.2所示的引物katG315-R；引物組2：包含堿基序列如SEQNO.3所示的引物inhA94-F和堿基序列如SEQNO.4所示的引物inhA94-R；引物組3：包含堿基序列如SEQNO.5所示的引物rpsL43-F和堿基序列如SEQNO.6所示的引物rpsL43-R；引物組4：包含堿基序列如SEQNO.7所示的引物embB330-F和堿基序列如SEQNO.8所示的引物embB330-R；引物組5：包含堿基序列如SEQNO.9所示的引物embB630-F和堿基序列如SEQNO.10所示的引物embB630-R。所述引物組特異性識別結核分枝桿菌耐藥性基因包括katG基因、inhA基因、rpsL基因和embB基因。所述引物組1特異性識別katG基因，所述引物組2特異性識別inhA基因，所述引物組3特異性識別rpsL基因，所述引物組4特異性識別embB基因，所述引物組5特異性識別embB基因。所述引物組1擴增序列如SEQNO.11所示，可檢測耐異煙肼相關的katG基因突變；所述引物組2擴增序列如SEQNO.12所示，可檢測耐異煙肼相關的inhA基因突變；所述引物組3擴增序列如SEQNO.13所示，可檢測耐鏈霉素相關的rpsL基因突變；所述引物組4和引物組5擴增序列分別如SEQNO.14和SEQNO.15所示，可檢測耐乙胺丁醇相關的embB基因突變。本專利技術提供了一種檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒，包括上述的五個引物組中至少一組引物組。所述的試劑盒，還包括：非標記熒光PCR反應液、陰性標準品、陽性標準品。所述的試劑盒，所述非標記熒光PCR的反應液，包括：Green-2-GoqPCRMastermix，5μl引物F，10μM，0.1μl引物R，10μM，0.1μlddH2O，4.3μl。所述的試劑盒，所述的Green-2-GoqPCRMastermix中含有EvaGreen染料。所述的試劑盒，所述陰性標準品和陽性標準品按照如下方法制備：分別合成基因katG、inhA、rpsL、embB野生型和突變型的序列，將合成的序列片段與載體pMD18-T連接，將連接產物轉化至感受態細胞，篩選得到單菌落，挑選單菌落至含抗生素的液體培養基，過夜培養，提取質粒，以提取的重組質粒DNA為模板進行PCR鑒定，并對重組質粒進行測序鑒定。提取驗證正確的重組陽性質粒和重組陰性質粒即為陽性標準品和陰性標準品。本專利技術提供了所述的引物組或所述的試劑盒在結核分枝桿菌耐藥基因預定位點進行突變檢測的應用，包括如下步驟：(1)提取待測樣品的基因組DNA；(2)使用所述的引物組或所述的試劑盒對所述基因組DNA進行非標記熒光PCR擴增；(3)采用genescan或calling軟件對PCR擴增產物進行HRM分析，綜合擴增曲線與Tm值判定結果。所述的應用，所述耐藥基因的預定位點包括：katG基因315位點、inhA基因94位點、rpsL基因43位點、embB基因330位點和embB基因630位點。所述應用的判定分析如下：對katG基因的突變分析結果如圖1所示，野生型katG基因Tm值>katG基因AGC→ACC突變Tm值>katG基因AGC→ATC突變和/或katG基因AGC→CGC突變Tm值>katG基因AGC→AAC突變Tm值；對inhA基因的突變分析結果如圖2所示，野生型inhA基因Tm值>inhA基因GCC→TCC突變Tm值>inhA基因GCC→TGC突變Tm值；對rpsL基因的突變分析結果本文檔來自技高網...

【技術保護點】
基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組，其特征在于，所述引物組包含至少一種選自以下的引物組：引物組1：包含堿基序列如SEQ?NO.1所示的引物katG315?F和堿基序列如SEQ?NO.2所示的引物katG315?R；引物組2：包含堿基序列如SEQ?NO.3所示的引物inhA94?F和堿基序列如SEQ?NO.4所示的引物inhA94?R；引物組3：包含堿基序列如SEQ?NO.5所示的引物rpsL43?F和堿基序列如SEQ?NO.6所示的引物rpsL43?R；引物組4：包含堿基序列如SEQ?NO.7所示的引物embB330?F和堿基序列如SEQ?NO.8所示的引物embB330?R；引物組5：包含堿基序列如SEQ?NO.9所示的引物embB630?F和堿基序列如SEQ?NO.10所示的引物embB630?R。

【技術特征摘要】
1.基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組，其特征在于，所述引物組包含至少一種選自以下的引物組：引物組1：包含堿基序列如SEQNO.1所示的引物katG315-F和堿基序列如SEQNO.2所示的引物katG315-R；引物組2：包含堿基序列如SEQNO.3所示的引物inhA94-F和堿基序列如SEQNO.4所示的引物inhA94-R；引物組3：包含堿基序列如SEQNO.5所示的引物rpsL43-F和堿基序列如SEQNO.6所示的引物rpsL43-R；引物組4：包含堿基序列如SEQNO.7所示的引物embB330-F和堿基序列如SEQNO.8所示的引物embB330-R；引物組5：包含堿基序列如SEQNO.9所示的引物embB630-F和堿基序列如SEQNO.10所示的引物embB630-R。2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組特異性識別結核分枝桿菌耐藥性基因包括katG基因、inhA基因、rpsL基因和embB基因。3.根據權利要求2所述的引物組，其特征在于，所述引物組1特異性識別katG基因，所述引物組2特異性識別inhA基因，所述引物組3特異性識別rpsL基因，所述引物組4特異性識別embB基因，所述引物組5特異性識別embB基因。4.一種基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-3任一項所述的基于HRM技術檢測結核分枝桿菌耐藥性基因突變的引物組。5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，還包括非標記熒光PCR反應液、陰性標準品和陽性標準品。6.根據權利要求4-5所述試劑盒，其特征在于，所述非標記熒光PCR反應液包括以下組分：Green-2-GoqPCRMastermix，5μl引...

【專利技術屬性】
技術研發人員：車團結，同重湘，尤崇革，謝小冬，李琳，李亞鵬，
申請(專利權)人：蘇州百源基因技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇,32