一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的比率型熒光探針及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。所述熒光探針為式Ⅰ所示化合物。本發(fā)明專利技術(shù)所述的熒光探針可應(yīng)用于生物樣品中丙氨酸氨肽酶的檢測(cè)和成像。該探針作為丙氨酸氨肽酶的特異性探針，僅在丙氨酸氨肽酶存在的條件下，能夠水解脫去探針中丙氨酸，生成具有新熒光信號(hào)的熒光物質(zhì)，熒光信號(hào)既可以表現(xiàn)為增強(qiáng)也可以表現(xiàn)為比率變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該酶的測(cè)定及成像。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的比率型熒光探針及其制備方法與應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于分子檢測(cè)和分子成像領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的比率型熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
丙氨酸氨肽酶是Ⅱ型膜結(jié)合金屬蛋白酶，能夠特異性的將N-末端的丙氨酸從肽鏈上切割下來(lái)，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)氨基酸的循環(huán)具有重要的意義。更重要的是，丙氨酸氨肽酶在生物體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用，是研究疾病診斷、治療的重要指標(biāo)。丙氨酸氨肽酶是重要的癌癥標(biāo)志物，臨床上尿丙氨酸氨肽酶也對(duì)腎臟疾病早期診斷有一定價(jià)值。由于目前用于丙氨酸氨肽酶檢測(cè)的熒光探針存在分析波長(zhǎng)短、檢測(cè)靈敏度低等弊端，試劑盒的操作又非常繁冗，因此，發(fā)展一種高靈敏的快速檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的熒光探針具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。甲酚紫因具有分析波長(zhǎng)長(zhǎng)、量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物分析中，而基于甲酚紫檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的長(zhǎng)波長(zhǎng)比率型熒光探針尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了一種式Ⅰ所示化合物：本專利技術(shù)進(jìn)一步提供了上述式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：1)在偶聯(lián)劑存在下，將Boc-丙氨酸與甲酚紫進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到式Ⅱ所示化合物；其中，Boc-丙氨酸表示叔丁氧羰基保護(hù)的丙氨酸；2)將式Ⅱ所示化合物在酸性條件下水解，得到上述式Ⅰ所示化合物。上述方法步驟1)中，所述偶聯(lián)劑具體可為2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。所述偶聯(lián)劑與Boc-丙氨酸的摩爾比可為1-3:1，具體可為1:1。所述Boc-丙氨酸與甲酚紫的摩爾比可為1:1-3，具體可為1:1.2。所述縮合反應(yīng)可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑具體可為二氯甲烷。所述縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為0-50℃，時(shí)間可為1-24小時(shí)。上述方法步驟2)中，所述水解具體可在三氟乙酸作用下進(jìn)行。所述水解的溫度可為0-50℃，時(shí)間可為0.5-24小時(shí)。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供了一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的試劑盒，包括式Ⅰ所示化合物。式Ⅰ所示化合物或上述試劑盒可應(yīng)用于生物樣品中丙氨酸氨肽酶的檢測(cè)及成像。本專利技術(shù)還提供了一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的方法。本專利技術(shù)所提供的檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的方法，包括下述步驟：(1)以磷酸鹽緩沖液為溶劑配制不同濃度的丙氨酸氨肽酶的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，向所述不同濃度的丙氨酸氨肽酶的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液中分別加入等量的式Ⅰ所示化合物，反應(yīng)，測(cè)量反應(yīng)后體系的熒光發(fā)射光譜；(2)提取熒光發(fā)射光譜中575nm和626nm處的熒光強(qiáng)度，記為F1、F2，計(jì)算熒光強(qiáng)度比值R＝F2/F1，以丙氨酸氨肽酶的濃度C為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度比值R為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)將待測(cè)樣品用所述磷酸鹽緩沖液稀釋，加入式Ⅰ所示化合物，使得體系中的式Ⅰ所示化合物的濃度與步驟(1)中式Ⅰ所示化合物在丙氨酸氨肽酶的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液中的濃度相等，反應(yīng)，測(cè)量反應(yīng)后體系的熒光發(fā)射光譜，計(jì)算626nm與575nm處的熒光強(qiáng)度比值R'；根據(jù)步驟(2)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到所述待測(cè)樣品中丙氨酸氨肽酶的含量。上述方法步驟(1)中，所述磷酸鹽緩沖液的pH可為7.4。所述不同濃度的丙氨酸氨肽酶的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的濃度分別為0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，15，30，50和100ng/mL。式Ⅰ所示化合物在所述標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液中的濃度可為0.5-10μM，具體可為5μM。所述反應(yīng)的溫度為15-42℃，具體可為37℃，時(shí)間為15-60分鐘，具體可為30分鐘。所述熒光發(fā)射光譜測(cè)量中，激發(fā)波長(zhǎng)具體可為525nm。本專利技術(shù)所述的熒光探針可應(yīng)用于生物樣品中丙氨酸氨肽酶的檢測(cè)和成像。該探針作為丙氨酸氨肽酶的特異性探針，僅在丙氨酸氨肽酶存在的條件下，能夠水解脫去探針中的丙氨酸，生成具有新熒光信號(hào)的熒光物質(zhì)，熒光信號(hào)既可以表現(xiàn)為增強(qiáng)也可以表現(xiàn)為比率變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該酶的測(cè)定及成像。本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本專利技術(shù)熒光探針在溶液中呈淺橙色，與丙氨酸氨肽酶反應(yīng)后，肉眼即可觀察到溶液變?yōu)槊黠@的紫紅色。2、本專利技術(shù)熒光探針具有長(zhǎng)的熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。3、本專利技術(shù)熒光探針?biāo)a(chǎn)生的熒光信號(hào)既可以表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)也可以表現(xiàn)為比率變化，能有效降低生物復(fù)雜環(huán)境的干擾。4、本專利技術(shù)對(duì)丙氨酸氨肽酶的響應(yīng)呈線性關(guān)系，可以用于該酶的定量測(cè)定。5、本專利技術(shù)對(duì)丙氨酸氨肽酶具有高靈敏的響應(yīng)，可與用于該酶的痕量測(cè)定。6、本專利技術(shù)僅在丙氨酸氨肽酶存在的條件下產(chǎn)生信號(hào)，其它常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、活性氧，特別其他的氨肽酶等均不產(chǎn)生干擾。7、本專利技術(shù)化合物溶解性好，可直接用于生物樣品中丙氨酸氨肽酶的檢測(cè)及成像。8、本專利技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，成本低，易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為本專利技術(shù)式I所示化合物的化學(xué)反應(yīng)方程式與合成路線。圖2為本專利技術(shù)熒光探針對(duì)不同濃度丙氨酸氨肽酶的熒光響應(yīng)圖。圖3為本專利技術(shù)熒光探針的熒光比率變化對(duì)丙氨酸氨肽酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為本專利技術(shù)試劑盒對(duì)不同物質(zhì)響應(yīng)的柱狀圖。圖5為本專利技術(shù)試劑盒分別用于LO2和HepG2細(xì)胞的共聚焦成像圖。圖6為本專利技術(shù)試劑盒分別用于正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞以及預(yù)先與抑制劑孵育過(guò)的HepG2細(xì)胞的共聚焦成像圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行說(shuō)明，但本專利技術(shù)并不局限于此。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試劑、材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、丙氨酸氨肽酶檢測(cè)的熒光探針(式Ⅰ化合物)的制備按照?qǐng)D1所示的化學(xué)反應(yīng)流程圖進(jìn)行制備。步驟1)：將1mmolBoc-丙氨酸、1mmolHATU及1mmolN-乙基二異丙胺溶于二氯甲烷中，在冰浴條加下反應(yīng)30分鐘。然后加入1.2mmol甲酚紫，室溫下反應(yīng)過(guò)夜后，過(guò)濾，然后濾液減壓蒸干，得到的粗產(chǎn)品。用柱層析分離提純得到式Ⅱ所示化合物。步驟2)：將0.1mmol式Ⅱ所示化合物溶于無(wú)水二氯甲烷中，然后加入三氟乙酸，在Ar氣保護(hù)下攪拌2小時(shí)，然后減壓蒸干，得到粗產(chǎn)品。用柱層析分離，得到最終產(chǎn)物(式Ⅰ)，產(chǎn)品為橘紅色固體。結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：1HNMR(400MHz,298K,CD3OD):δ8.84(d,1H,J＝8.0Hz),8.38(d,1H,J＝8.0Hz),8.17(s,1H),8.00(t,1H,J＝7.2Hz),7.92(m,2H),7.65(d,1H,J＝8.0Hz),6.92(s,1H),4.25(m,1H,J＝6.8Hz),1.67(d,1H,J＝6.8Hz).13CNMR(100MHz,298K,CD3OD):δ179.9,169.8,162.4,154.8,147.5,143.6,143.0,142.6,133.6,130.5,130.3,129.5,128.8,123.8,120.0,118.1,115.9,114.3,107.4,105.8,53.9,52.2,47.8,41.6,30.2,28.2,25.5,25.0,23.3,22.4,21.9,21.6,11.6.HR-ESI-MS:m/zcalcd.(C19H16N4O2+,M+),333.1273；found,333.1345.由上述譜圖數(shù)據(jù)，可確認(rèn)本實(shí)施例制備得到的化合物的結(jié)構(gòu)式為式Ⅰ。實(shí)施例2、熒光探針在檢測(cè)丙氨酸氨肽酶中的應(yīng)用1)稱取3.33mg實(shí)施例1所得式I化合物為熒光探針，溶本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
式Ⅰ所示化合物：

【技術(shù)特征摘要】
1.式Ⅰ所示化合物：2.權(quán)利要求1中式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：1)在偶聯(lián)劑存在下，將Boc-丙氨酸與甲酚紫進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到式Ⅱ所示化合物；其中，Boc-丙氨酸表示叔丁氧羰基保護(hù)的丙氨酸；2)將式Ⅱ所示化合物在酸性條件下水解，得到上述式Ⅰ所示化合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟1)中，所述偶聯(lián)劑為2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；所述偶聯(lián)劑與Boc-丙氨酸的摩爾比為1-3:1；所述Boc-丙氨酸與甲酚紫的摩爾比為1:1-3；所述縮合反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行；所述縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度為0-50℃，時(shí)間為1-24小時(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：步驟2)中，所述水解在三氟乙酸作用下進(jìn)行；所述水解的溫度為0-50℃，時(shí)間可為0.5-24小時(shí)。5.一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的試劑盒，包括式Ⅰ所示化合物。6.權(quán)利要求1中式Ⅰ所示化合物或權(quán)利要求5中的試劑盒在丙氨酸氨肽酶檢測(cè)和成像中的應(yīng)用。7.一種檢測(cè)丙氨酸氨肽酶的方法，包括下述步驟：(1)以磷酸鹽緩沖液為溶劑配制不同濃度的丙氨酸氨肽酶的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，向...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬會(huì)民，史文，賀新元，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京,11