一種體外免疫細胞制劑的修飾方法及其應用技術

本發明專利技術提供了一種體外免疫細胞制劑的修飾方法及應用。該方法用MOG

【技術實現步驟摘要】
一種體外免疫細胞制劑的修飾方法及其應用
本專利技術涉及細胞生物學領域，具體涉及體外免疫細胞制劑的修飾方法及其應用。
技術介紹
多發性硬化(MS)是一種病因及發病機制尚未完全闡明的中樞神經系統(CNS)免疫炎性脫髓鞘/變性疾病，傾向于青壯年罹患，且呈慢性病程，反復發作，進行性運動功能障礙，甚至癱瘓，給家庭和社會帶來沉重的負擔。迄今為止，MS尚無有效的治愈手段，主要是抑制炎性脫髓鞘病變進展，防止急性期病變惡化及緩解期復發，對癥和支持療法以減輕神經功能障礙帶來的痛苦。目前中國MS患者的治療更是困難重重，包括FAD批準的用于治療該病的藥物，如β-干擾素(IFN-β)、醋酸格拉太咪爾(GA)、那他珠單抗(NTZ)、Fingolimod(FTY270)等(Deograciasetal.,2012)，雖能一定程度緩解癥狀，減少復發，但并非對所有患者均有效，且不能影響不可逆的功能障礙及疾病的進展。此外，最重要的是這些藥物要么沒有進入中國市場，要么價格昂貴。而MS患者需要長期或終生治療，昂貴的費用使得絕大多數中國MS患者無法承受。因此，皮質類固醇仍然是目前中國MS患者的主要治療藥物，具有抗炎和免疫調節作用，可促進急性復發的恢復和縮短復發期病程，但不能改善恢復程度，長期應用不能防止復發，且可出現嚴重不良反應，如骨質疏松、肌肉萎縮、糖尿病等(MinagarA.,2013)。近幾年干細胞移植為神經變性疾病的治療提供了廣闊的前景。造血干細胞(HSC)移植通過免疫重建，使CNS產生免疫耐受，以達到治療目的，但HSC移植只有在MS患者其他治療手段無效的情況下才考慮應用。神經干細胞(NSCs)是來源于神經組織或能分化為神經組織，具有自我更新能力和多向分化潛能的一類細胞，已成為治療神經變性疾病的熱點。隨著NSCs研究的深入，越來越多的理論和技術問題有待進一步完善和規范：①NSCs的來源選擇：NSCs在神經組織中的位置比較深，獲得自體NSCs就會對機體造成一定的損傷；如果從胎兒體內獲取NSCs，即使是流產的胎兒，也存在倫理問題。②NSCs的數量：研究發現，NSCs對神經行為功能改善有明顯的劑量依賴性，低于一定劑量，不能改善功能，而自體很難獲得足夠量的NSCs。③NSCs的免疫反應：腦組織是一個相對免疫缺陷器官，NSCs具有低免疫原性的特點。在理論上，NSCs作為一種處于相對原始狀態的細胞，不表達成熟細胞抗原。然而，大量實驗證實，新分離的和傳代的NSCs細胞膜表面均有MHCI類和II類分子表達，說明其仍然存在一定免疫原性，異體NSCs移植不可避免存在免疫排斥反應。④NSCs的安全性：體外培養的NSCs因傳代過多而活力下降，生物學性狀部分改變，作為轉基因載體NSCs存在可能帶來潛在致病基因，甚至發生惡性轉變等問題，因此NSCs移植在體內的成瘤性問題及其增殖、分化和遷移等仍需長期觀察(Joyceetal.,2010；Lukovicetal.,2015；Ratajczaketal.,2014)。MS是以髓鞘特異性自身反應性CD4+T細胞介導為主的自身免疫性疾病，一直以來Th1/Th2細胞反應失衡被認為在MS的發生發展中起重要作用。Th1和Th2是CD4+T細胞分化的，功能和細胞因子分泌方式相反的2種輔助性T(Th)細胞。Th1可分泌致炎性細胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等，輔助細胞免疫，介導細胞毒作用；而IFN-γ、IL-1β等又可促進T細胞、巨噬細胞的活化和浸潤，使炎性病灶進一步擴大(Jiangetal.,2006)。Th2可分泌IL-4、IL-10、TGF-β等，輔助體液免疫，對Th1細胞的增殖呈負反饋效應(Zhouetal.,2014)。在MS的病理過程中除Thl細胞外，由CD4+T細胞分化而來的Th17細胞似乎在MS中發揮更為重要作用。Th17細胞是獨立于Th1和Th2細胞的Th細胞亞群，分泌IL-17為細胞因子，后者是一種較強的致炎性細胞因子，可誘導IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌，介導組織炎癥及破壞(Kanakasabaietal.,2011)。其中Thl和Th17是MS的主要參與者，其表達與MS的嚴重程度呈正相關；而Th2細胞作為免疫調節細胞或抑制性T細胞，具有免疫調節、抗炎、髓鞘保護作用，能改善MS發病的嚴重程度(Munegowdaetal.,2011；Liuetal.,2013)。另外，巨噬細胞作為外周免疫系統重要的抗原遞呈細胞(APC)，具有激活T細胞，遷移，包圍死細胞及清除細胞碎片等多種生物學行為(Erogluetal.,2010)。系列研究發現，巨噬細胞是一種具有可塑性和多功能的細胞群體，其表型和功能狀態可隨微環境的改變發生明顯變化，表現極大的特質性。近年來巨噬細胞的極化受到普遍關注，并受各種微環境信號的誘導與調節(Zhangetal.,2013)。Th1型細胞因子IFN-γ促使單核細胞向M1型巨噬細胞分化。M1型巨噬細胞作為APC參與Th1和Th17T細胞激活，由此產生的IFN-γ和TNF-α則可進一步使M1炎性巨噬細胞分化和激活，從而放大免疫炎性反應。因此，M1型巨噬細胞在MS疾病的發生發展中起重要的促進作用。M2型巨噬細胞則可由Th2型細胞因子IL-4和IL-10等分化和激活，參與介導Th2細胞和CD4+CD25+調節性T細胞的分化，為改善EAE炎性反應微環境，減少髓鞘脫失和神經元變性奠定了細胞分子基礎(Mikitaetal.,2011；Jiangetal.,2014)。總而言之，免疫炎性是介導MS發病的重要機制，基于此我們可以設想一種新的MS干預治療策略，即一種體外修飾免疫炎性細胞，使其功能發生逆轉，然后回輸的治療方法。
技術實現思路
實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)與MS具有許多相似的臨床表現和病理過程，被認為是探討MS治療策略的理想動物模型。抑制Rho激酶(ROCK)表達目前被認為是治療MS或神經變性病的潛在藥物靶點。Fasudil作為選擇性ROCK抑制劑，大量研究表明其具有調節免疫細胞，減輕微血管通透性增加，減少炎癥細胞遷移及保護受損神經元等功能。我們知道MS是一個復發-緩解，且需要長期治療的慢性疾病，雖然Fasudil顯示了良好的治療效果，但迅速明顯的血管擴張作用，口服生物利用度很差，藥物口服劑型的研發一直沒有成功，長期使用的安全窗較小等因素限制了其在MS患者的臨床應用。針對MS的發生機制、治療現狀及Fasudil治療MS的優缺點，本專利技術提供以下各項：1.一種體外修飾免疫細胞的方法，所述方法包括將免疫細胞用Fasudil體外修飾。2.一種免疫細胞，所述免疫細胞用Fasudil體外修飾。3.一種制劑，所述制劑包含用Fasudil體外修飾的免疫細胞。4.根據1所述的方法、2所述的免疫細胞或3所述的制劑，其中所述免疫細胞是T細胞或巨噬細胞。5.根據1所述的方法、2所述的免疫細胞或3所述的制劑，其中所述免疫細胞分離自小鼠EAE模型。6.一種用于治療神經變性疾病的試劑盒，所述試劑盒中包含2所述的免疫細胞或3中所述的制劑。7.根據6所述的試劑盒，所述神經變性疾病包括多發性硬化。8.2所述的免疫細胞或3所述的制劑在制備用于治療神經變性疾病的試劑盒中的用途，所述治療包括本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種體外修飾免疫細胞的方法，所述方法包括將免疫細胞用Fasudil體外修飾。

【技術特征摘要】
2016.11.10 CN 20161098979141.一種體外修飾免疫細胞的方法，所述方法包括將免疫細胞用Fasudil體外修飾。2.一種免疫細胞，所述免疫細胞用Fasudil體外修飾。3.一種制劑，所述制劑包含用Fasudil體外修飾的免疫細胞。4.根據權利要求1所述的方法、權利要求2所述的免疫細胞或權利要求3所述的制劑，其中所述免疫細胞是T細胞或巨噬細胞。5.根據權利要求1所述的方法、權利要求2所述的免疫...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉春云，郭尚德，尉杰忠，李艷花，肖保國，馬存根，
申請(專利權)人：山西大同大學，
類型：發明
國別省市：山西,14