一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于人工模擬酶領(lǐng)域，提供了一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽,氨基酸序列為YGRKKRRQRRRHQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRD?GSLWPFLRHNVYGRPRAUVVHAGED,其特點(diǎn)是，結(jié)構(gòu)中除了含有使細(xì)胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(TAT)序列外，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)催化活性中心和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu),因此，兼具SOD和GPx協(xié)同抗氧化能力，在因自由基紊亂誘發(fā)的疾病的藥物應(yīng)用中具有極大的潛力。并提供其科學(xué)合理，簡單實(shí)用的制備方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽及其制備方法
本專利技術(shù)涉及人工模擬酶領(lǐng)域，是一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，具體地說，是一種通過基因重組技術(shù)制備的具有超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)雙活性的含硒金屬76肽化合物。
技術(shù)介紹
機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡和人類重大疾病的發(fā)生與發(fā)展息息相關(guān)，且機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡的維持需要依靠諸多抗氧化酶間的協(xié)同作用，僅對單一功能酶的研究很難深入探索這個(gè)復(fù)雜體系的作用機(jī)制，而進(jìn)行構(gòu)建具有多種抗氧化活性的模擬酶，有利于對抗氧化多酶體系中各種抗氧化酶的協(xié)同作用進(jìn)行深入研究。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPx)作為生物體天然抗氧化酶系的重要成員，大量研究表明兩者的相互協(xié)同作用對清除和人類多種疾病相關(guān)的高濃度的ROS(reactiveoxygenspecies,ROS)具有重要作用。因此，對SOD和GPx協(xié)同抗氧化效應(yīng)的模擬化合物的研究至關(guān)重要。本申請人所在博士課題組曾經(jīng)以具有晶體結(jié)構(gòu)的SOD3為模板，保留了其活性必須的氨基酸序列，引入了SOD活性中心的Cu2+和穩(wěn)定活性基團(tuán)的Zn2+，同時(shí)插入了一段具有GPx底物GSH特異性結(jié)合位點(diǎn)的15肽，又通過結(jié)構(gòu)模擬，在特定部位引入了除GPx活性殘基Sec以外的對穩(wěn)定活性部位起到至關(guān)重要的氨基酸殘基Gln和Trp組成催化三聯(lián)體，并利用Cys營養(yǎng)缺陷型表達(dá)系統(tǒng)，獲得一種具有精巧的雙酶活性中心結(jié)構(gòu)域的銅鋅含硒65肽即Se-CuZn-65P。相對大分子量模擬物，65P作為短肽提高了穿透細(xì)胞的效率，但效果依然不夠理想。基于此，申請人在Se-CuZn-65P的氨基端連接上人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)反式轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activatoroftranscription,TAT)的蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，即細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptide,CPP)，使其具有穿透生物膜的能力，命名為Se-CuZn-76P，借助計(jì)算機(jī)模擬功能建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，并與Se-CuZn-65P進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對，分析其活性部位，預(yù)測其活性變化。然后在單一蛋白生產(chǎn)(singleproteinproduction,SPP)系統(tǒng)中進(jìn)行半胱氨酸缺陷表達(dá)(cysteineauxotrophicexpression)，酶學(xué)特征及穿膜能力鑒定表明，Se-CuZn-76是一種具有雙酶活性，位點(diǎn)清晰，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，催化機(jī)理明確且具有穿膜作用和抗氧化協(xié)同效應(yīng)的小分子76肽，其對闡明酶的催化機(jī)理以及相互間協(xié)同作用有重要意義，而且還有廣闊的藥用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的之一是，提供一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，通過引入系列催化氨基酸群和蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，建立具有細(xì)胞膜穿透效應(yīng)并兼具SOD和GPx催化活性的新型雙功能模擬酶，其把SOD活性中心結(jié)構(gòu)域和GPx活性中心結(jié)構(gòu)域有機(jī)整合在一起，使它們能夠在各自發(fā)揮活性的基礎(chǔ)上又能相互協(xié)同作用，細(xì)胞穿膜肽使其具有穿透生物膜的能力，賦予其廣闊的藥用前景。本專利技術(shù)的另一目的是，提供一種科學(xué)合理，簡單實(shí)用的兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽的制備方法。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的之一采用的技術(shù)方案是：一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，結(jié)構(gòu)中含有使細(xì)胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(Trans-activatingtranscriptionalactivator,TAT)序列，其特征是，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)相似的結(jié)構(gòu)，其氨基酸一級序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的之二采用的技術(shù)方案是：一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽的制備方法，其特征是，它包括以下步驟：1)Se-CuZn-76P分子模型的建立與分析以Se-CuZn-65P氨基酸序列為基礎(chǔ)，連接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST數(shù)據(jù)庫和Homology模塊進(jìn)行同源序列比對并建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測其活性變化；BLAST搜索表明，天然SOD1(PDBentry1HL5,1AZV)，SOD3(PDBentry2JLP)蛋白結(jié)構(gòu)與Se-CuZn-76P有較高的同源性，依據(jù)其空間結(jié)構(gòu)建立Se-CuZn-76P三維模型，優(yōu)化后獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其具有發(fā)揮GPx活性的催化三聯(lián)體(catalytictriad)結(jié)構(gòu)和發(fā)揮SOD活性的金屬離子配位(metalion-coordinated)結(jié)構(gòu)；2)pColdⅠ(sp-4)-76P重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照OMEGAPlasmidMiniKitI質(zhì)粒提取試劑盒說明書:將帶有質(zhì)粒的E.coli接種于5mLLB/抗生素培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)16h；分次取5.0mL的菌液，室溫下10000×g離心1min收集細(xì)菌,倒棄培養(yǎng)基；加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混合液，旋窩震蕩使細(xì)胞完全懸浮；加入250μlSolutionⅡ，輕輕顛倒混勻6次；加入350μlSolutionⅢ，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；室溫下，≥10000×g離心10min；轉(zhuǎn)移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA結(jié)合柱中，室溫下，10000×g離心1min，倒去收集管中的濾液；把柱子重新裝回收集管，加入500μlHBBuffer，按上述條件離心，棄去濾液；把柱子重新裝回收集管，加入700μlDNAWashBuffer按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNAWashBuffer在使用之前必需按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋，重復(fù)一次；棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，10000×g離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)；把柱子裝在干凈的1.5mL離心管上，加入50μlElutionBuffer到柱子基質(zhì)中，靜置2min，10000×g離心1min洗脫出DNA。對pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB質(zhì)粒進(jìn)行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對這兩個(gè)質(zhì)粒分別雙酶切，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，雙酶切和連接體系如下：雙酶切體系20μL如下：37℃溫育4h，1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果并回收酶切片段；連接體系10μL如下：雙酶切后的76P基因4.5μL雙酶切后的pColdⅠ(sp-4)載體1.5μLH2O2.5μ本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，結(jié)構(gòu)中含有使細(xì)胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(Trans?activating?transcriptional?activator,TAT)序列，其特征是，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)相似的結(jié)構(gòu)，其氨基酸一級序列為：Tyr?Gly?Arg?Lys?Lys?Arg?Arg?Gln?Arg?Arg?Arg?His?Gln?His?Gln?Phe?Gly?Asp?Leu?Ser?Gln?Gly?Ala?Glu?Ser?Thr?Gly?Pro?His?Tyr?Asn?Pro?Leu?Ala?Val?Pro?His?Pro?Gln?His?Pro?Gly?Asp?Trp?Gly?Asn?Phe?Ala?Val?Arg?Asp?Gly?Ser?Leu?Trp?Pro?Phe?Leu?Arg?His?Asn?Val?Tyr?Gly?Arg?Pro?Arg?Ala?Sec?Val?Val?His?Ala?Gly?Glu?Asp。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，結(jié)構(gòu)中含有使細(xì)胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(Trans-activatingtranscriptionalactivator,TAT)序列，其特征是，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)相似的結(jié)構(gòu)，其氨基酸一級序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種兼具細(xì)胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，其特征是，它的制備方法，包括以下步驟：1)Se-CuZn-76P分子模型的建立與分析以Se-CuZn-65P氨基酸序列為基礎(chǔ)，連接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST數(shù)據(jù)庫和Homology模塊進(jìn)行同源序列比對并建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測其活性變化；BLAST搜索表明，天然SOD1(PDBentry1HL5,1AZV)，SOD3(PDBentry2JLP)蛋白結(jié)構(gòu)與Se-CuZn-76P有較高的同源性，依據(jù)其空間結(jié)構(gòu)建立Se-CuZn-76P三維模型，優(yōu)化后獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其具有發(fā)揮GPx活性的催化三聯(lián)體(catalytictriad)結(jié)構(gòu)和發(fā)揮SOD活性的金屬離子配位(metalion-coordinated)結(jié)構(gòu)；2)pColdⅠ(sp-4)-76P重組質(zhì)粒的構(gòu)建參照OMEGAPlasmidMiniKitI質(zhì)粒提取試劑盒說明書:將帶有質(zhì)粒的E.coli接種于5mLLB/抗生素培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)16h；分次取5.0mL的菌液，室溫下10000×g離心1min收集細(xì)菌,倒棄培養(yǎng)基；加入250μlSolutionⅠ/RNaseA混合液，旋窩震蕩使細(xì)胞完全懸浮；加入250μlSolutionⅡ，輕輕顛倒混勻6次；加入350μlSolutionⅢ，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；室溫下，≥10000×g離心10min；轉(zhuǎn)移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA結(jié)合柱中，室溫下，10000×g離心1min，倒去收集管中的濾液；把柱子重新裝回收集管，加入500μlHBBuffer，按上述條件離心，棄去濾液；把柱子重新裝回收集管，加入700μlDNAWashBuffer按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNAWashBuffer在使用之前必需按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋，重復(fù)一次；棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，10000×g離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)；把柱子裝在干凈的1.5mL離心管上，加入50μlElutionBuffer到柱子基質(zhì)中，靜置2min，10000×g離心1min洗脫出DNA；對pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB質(zhì)粒進(jìn)行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對這兩個(gè)質(zhì)粒分別雙酶切，再用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，雙酶切和連接體系如下：雙酶切體系20μL如下：37℃溫育4h，1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果并回收酶切片段；連接體系10μL如下：雙酶切后的76P基因4.5μL雙酶切后的pColdⅠ(sp-4)載體1.5μLH2O2.5μL45℃溫育5min，冷卻至室溫，使酶切的目的基因和載體進(jìn)行粘端退火連接，然后加入10×連接緩沖液1μL，T4DNA連接酶0.5μL，16℃連接16h；重組質(zhì)粒經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)菌株中，在含有100μg/mLAmp的盧-貝(Luria-Bertani,LB)固體培養(yǎng)基中篩選后，挑取單克隆在含有100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)，提取pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒，再用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定；pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒為4587bp，由76P氨基端被轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件(translationenhancingelement,TEE)、6×組氨酸標(biāo)簽(6×His-Ta...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐亞維，尹銳，楚海嬌，楊祥波，田瑞雪，劉曉丹，葉飛，高桂鳳，王程，閆飛，閆崗林，
申請(專利權(quán))人：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：吉林,22