一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，探針序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發(fā)明專利技術(shù)還公開(kāi)了用于檢測(cè)氣溶膠樣本多殺性巴氏桿菌的試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的含量及其分布情況，預(yù)報(bào)巴氏桿菌病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為場(chǎng)區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途
本專利技術(shù)涉及微生物檢測(cè)
，具體涉及一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。
技術(shù)介紹
多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamutocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的革蘭氏陰性病原菌，一般寄生于動(dòng)物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可引起帶菌動(dòng)物發(fā)生出血性敗血病或呼吸系統(tǒng)疾病。家畜中以牛、豬、兔、綿羊發(fā)病較多，山羊、鹿、駱駝、馬、驢、犬、貓和水貂等亦可感染發(fā)病。禽類中以雞、火雞和鴨最易感，鵝、鴿次之。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將Pm分為5個(gè)血清型(A、B、D、E、F)。在我國(guó)，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛的主要為莢膜A型和B型Pm，莢膜A型主要表現(xiàn)為牛纖維素性化膿性肺炎，莢膜B型主要表現(xiàn)為牛出血性敗血癥。由于Pm可以在同種或不同種動(dòng)物間互相傳染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重。多殺性巴氏桿菌病主要通過(guò)呼吸道和消化道傳播，在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中病畜、病禽的排泄物、分泌物及帶菌動(dòng)物將多殺性巴氏桿菌排向環(huán)境，細(xì)菌漂浮在空氣中，形成病原氣溶膠，健康動(dòng)物經(jīng)呼吸道吸入多殺性巴氏桿菌氣溶膠后即可感染。由于巴氏桿菌病原血清型復(fù)雜，各型之間沒(méi)有交叉保護(hù)性，疫苗防控本病難度較大，通過(guò)定期監(jiān)測(cè)，結(jié)合衛(wèi)生消毒及生物安全等可有效預(yù)防本病的發(fā)生。多殺性巴氏桿菌病的病原學(xué)診斷方法主要有細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等，但這些方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、準(zhǔn)確率低，不適合臨床快速診斷和監(jiān)測(cè)的需要，很難做到早期預(yù)警和隱性感染牛的篩查。以環(huán)境氣溶膠樣本為監(jiān)測(cè)對(duì)象，應(yīng)用靈敏、特異和快速的Real-TimePCR方法可以有效地進(jìn)行群體監(jiān)測(cè)，并對(duì)牛場(chǎng)衛(wèi)生消毒和生物安全效果進(jìn)行評(píng)估。但由于多殺性巴氏桿菌氣溶膠中細(xì)菌的含量很低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求很高，再加之氣溶膠樣本的采集相對(duì)較困難，因此，目前還未有針對(duì)多殺性巴氏桿菌氣溶膠采用TaqMan技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的目的是提供一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：第一方面，本專利技術(shù)提供一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，探針序列如SEQIDNO.3所示。具體序列如下：正向引物：5′-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3′；(SEQIDNO.1)反向引物：5′-GACAAGGAAATATAAACCGGCAAA-3′；(SEQIDNO.2)探針：5′-(Cy5)TCCTTGACAACGGCGCAACTGATTG(BHQ-2)-3′(SEQIDNO.3)。第二方面，本專利技術(shù)提供一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對(duì)照和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑。所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如SEQIDNo.4所示(241個(gè)堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；具體如下：5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAATATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCGGTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAACGGTTTAAT-3'；(SEQIDNO.4)所述陰性對(duì)照為pEASY-Y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。第三方面，本專利技術(shù)提供一種非診斷目的的檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；(3)以提取的基因組總DNA為模板，采用上述的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增體系的擴(kuò)增曲線對(duì)環(huán)境氣溶膠樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌進(jìn)行判斷，擴(kuò)增曲線Ct值≤37.0時(shí)，擴(kuò)增曲線成S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；當(dāng)擴(kuò)增曲線Ct值＞37.0時(shí)，擴(kuò)增曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測(cè)結(jié)果為陰性。步驟(1)中，采集環(huán)境氣溶膠樣本的方法為：采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-impinger，簡(jiǎn)稱AGI)，以30mL含0.01％(V/V)牛血清白蛋白的PBS(pH7.0)為采樣介質(zhì)，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的氣溶膠樣本。步驟(2)中，提取氣溶膠樣本的基因組總DNA的方法為：將采集到的氣溶膠樣本在室溫下離心，棄上清液，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑盒)提取總DNA。步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，包括2×ProbeqPCRMix10μL，模板1μL，10μmol/L的正向引物和反向引物各0.8μL，探針0.6μL，RNaseFreeddH2O6.8μL。步驟(3)中，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：預(yù)變性95℃30s，然后95℃變性5s、61℃退火延伸30s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)，最后40℃30s反應(yīng)結(jié)束。本專利技術(shù)的有益效果：(1)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)多殺性巴氏桿菌的防治現(xiàn)狀及危害的分析，本專利技術(shù)選擇多殺性巴氏桿菌Kmt1基因所共有的序列設(shè)計(jì)合成引物，建立TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，可將養(yǎng)殖場(chǎng)氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌和其它病原進(jìn)行區(qū)分，并在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中開(kāi)展多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)中不同環(huán)境區(qū)域，包括動(dòng)物飼養(yǎng)舍、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、擠奶廳及產(chǎn)房等采集氣溶膠樣品，利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的含量及其分布情況，預(yù)報(bào)巴氏桿菌病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為場(chǎng)區(qū)衛(wèi)生消毒試劑的選擇、使用次數(shù)及重點(diǎn)消毒區(qū)域的確定提供參考。(2)本專利技術(shù)的試劑盒可以檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠中多殺性巴氏桿菌，具有簡(jiǎn)捷快速、靈敏特異、低廉準(zhǔn)確及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。利用本專利技術(shù)的方法可以對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境氣溶膠中的多殺性巴氏桿菌的流行與隱性感染進(jìn)行群體監(jiān)測(cè)，為養(yǎng)殖場(chǎng)多殺性巴氏桿菌病的防控提供技術(shù)支持，也可以開(kāi)展多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，為多殺性巴氏桿菌病的科學(xué)防控提供理論支撐。(3)本專利技術(shù)建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌方法，通過(guò)倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，最低濃度為5.0個(gè)拷貝/反應(yīng)。以多殺性巴氏桿菌、牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、絲狀支原體絲狀亞種SC型等基因組DNA等為模板，在建立的檢測(cè)方法下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明僅有多殺性巴氏桿菌有陽(yáng)性擴(kuò)增，其他菌株擴(kuò)增均為陰性，表明與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。對(duì)3個(gè)不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)檢測(cè)和批間檢測(cè)，計(jì)算出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，其批內(nèi)誤差和批間誤差均小于10本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，探針序列如SEQ?ID?NO.3所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，探針序列如SEQIDNO.3所示。2.權(quán)利要求1所述的引物和探針組合在制備環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌檢測(cè)的試劑盒、芯片和/或擴(kuò)增反應(yīng)試劑中的用途。3.一種檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物和探針組合。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對(duì)照和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如SEQIDNo.4所示的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成。6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為pEASY-Y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。7.一種非診斷目的的檢測(cè)環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；(3)以提取的基因組總DNA為模板，采用上述的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增體系...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何洪彬，趙貴民，侯佩莉，王洪梅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東,37